माउस Preimplantation भ्रूण में वंश विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल माउस preimplantation भ्रूण में वंश विनिर्देश अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के सीटू विश्लेषण में मात्रात्मक, एकल कोशिका प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। ब्लास्टोसिस्ट के संग्रह के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं, पूरे माउंट प्रोटीन के immunofluorescent का पता लगाने, एक confocal खुर्दबीन और परमाणु विभाजन और छवि विश्लेषण पर नमूनों की इमेजिंग वर्णित हैं।
Abstract
इस प्रोटोकॉल एक विधि मात्रात्मक प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत करता है, बगल में एकल कोशिका वंश विनिर्देश अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है माउस preimplantation भ्रूण में। भ्रूण संग्रह, immunofluorescence, एक confocal खुर्दबीन पर इमेजिंग, और छवि विभाजन और विश्लेषण के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं वर्णित हैं। इस विधि के कई परमाणु मार्करों की अभिव्यक्ति और स्थानिक (xyz) के quantitation भ्रूण में सभी कोशिकाओं के निर्देशांक की अनुमति देता है। यह मिनट, विशेष रूप से preimplantation भ्रूण और भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) कालोनियों के confocal छवियों के विश्लेषण के लिए विकसित की एक छवि विभाजन सॉफ्टवेयर उपकरण का लाभ लेता है। मिनट एक्स, वाई और जेड आयाम भर में पूछना परमाणु विभाजन किया जाता है, और कम से कम उपयोगकर्ता इनपुट के साथ सभी चैनलों के लिए तीन आयामी अंतरिक्ष में सेल की स्थिति के बारे में जानकारी, साथ ही परमाणु प्रतिदीप्ति स्तरों पैदा करता है। इस प्रोटोकॉल छवियों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है जबकिpreimplantation चरण माउस भ्रूण की, यह आसानी से एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात और जहां उच्च परमाणु घनत्व (भ्रूणीय स्टेम सेल की अभिव्यक्ति विश्लेषण छवि विभाजन के लिए एक बाधा बन गया है जैसे।, प्रदर्शन किसी अन्य नमूनों के विश्लेषण (ईएससी के लिए अनुकूलित किया जा सकता ) कालोनियों संस्कृति में कोशिकाओं, अन्य प्रजातियों या चरणों, आदि) के भ्रूण का फर्क।
Introduction
माउस preimplantation भ्रूण सेल भाग्य विनिर्देश और स्तनधारियों में नए सिरे से epithelialization के अध्ययन के लिए उद्भव और इन विवो में pluripotency के रखरखाव, साथ ही एक मॉडल का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिमान है। और दो extraembryonic प्रजातियों, ट्रोफेक्टोडर्म (ते) और – जो सबसे दैहिक ऊतकों और जनन कोशिकाओं को जन्म देता है – स्तनधारी विकास की preimplantation चरणों तीन सेल प्रजातियों कि ब्लास्टोसिस्ट, अर्थात् pluripotent आद्यबहिर्जनस्तर बनाने की स्थापना के लिए समर्पित कर रहे हैं आदिम endoderm (पूर्व) (चित्रा 1 ए) 1,2। इस प्रोटोकॉल (1) फसल और ठीक preimplantation चरण माउस भ्रूण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, (2) immunofluorescence प्रदर्शन हित के प्रोटीन लेबल करने के लिए, (3) पूरे माउंट बाहर ले जाने के जेड सेक्शनिंग क्षमताओं और के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग इमेजिंग (4) confocal छवियों और बाद में मात्रात्मक छवि का विश्लेषण के परमाणु विभाजन प्रदर्शन करते हैं। इस पाइपलाइन टी की अनुमति देता हैवह सेल पहचान के काम में सीटू कोशिकाओं के उप-जनसंख्या को चिह्नित करने के लिए प्रोटीन के स्तर की माप निष्पक्ष। 4 दिन एक भी कूड़े (आम तौर पर 10 माउस भ्रूण तक) के लिए, भ्रूण संग्रह से डेटा विश्लेषण (चित्रा 1 बी) के लिए – इस प्रोटोकॉल बाहर के रूप में छोटे रूप में 3 में किया जा सकता है। कई litters के एक साथ विश्लेषण और इमेजिंग डेटा विश्लेषण समय का बोझ बढ़ जाएगा, इस प्रकार प्रोटोकॉल की कुल लंबाई का विस्तार।
Preimplantation चरण माउस भ्रूण एक प्रयोगात्मक विनयशील प्रणाली है जो, अपने छोटे आकार और आकृति विज्ञान टकसाली 3 दी, अच्छी तरह से एकल कोशिका संकल्प के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की पूर्ण इमेजिंग में के लिए अनुकूल है। एक निष्पक्ष, सिस्टम-स्तर भ्रूण की एक सांख्यिकीय प्रासंगिक संख्या के विश्लेषण से बाहर ले जाने के लिए, एक स्वचालित, मात्रात्मक विश्लेषण पाइपलाइन वांछनीय है। हालांकि, आंतरिक कोशिका द्रव्यमान का उच्च घनत्व परमाणु ब्लास्टोसिस्ट की (आईसीएम) की वजह से ( <stरोंग> चित्रा 1 ए, 2 डी), पारंपरिक छवि विभाजन प्लेटफॉर्म एक स्वचालित या अर्ध-स्वचालित कार्यप्रवाह स्थापित करने के लिए पर्याप्त सटीकता प्रदान करने में विफल। दूसरी ओर, मैनुअल विभाजन है, जबकि सही, कोशिकाओं और भ्रूण की बड़ी साथियों के प्रसंस्करण की अनुमति नहीं है, और न ही यह सेल पहचान की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, निष्पक्ष निर्धारण के लिए उपयुक्त है – जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब विकास के चरणों का अध्ययन जहां मार्कर के पैटर्न अभिव्यक्ति पूरी तरह से हल नहीं किया है (जैसे, एक जनसंख्या भर में एक द्विआधारी वितरण प्रदर्शन नहीं करते हैं)। हमने हाल ही में विकसित किया है और पुष्टि माउस preimplantation चरण भ्रूण के लिए और माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ESCs) है कि उच्च सटीकता प्राप्त अनुरूप एक छवि विभाजन विधि, जबकि न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट 4-8 की आवश्यकता होती है।
विश्लेषण यहाँ प्रस्तुत पाइपलाइन MATLAB आधारित छवि विभाजन उपकरण मॉड्यूलर इंटरएक्टिव परमाणु विभाजन (मिनट) 4 के आसपास घूमती है। मिनट पीconfocal जेड के ढेर के बड़े समूहों पर पूछना परमाणु विभाजन erforms के बाद उपयोगकर्ता, छवि गुण की एक न्यूनतम संख्या की स्थापना की है एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) (तालिका 1) 4 का उपयोग कर। इस पाइपलाइन प्रोटीन अभिव्यक्ति और दोनों जंगली प्रकार में सेल स्थानीयकरण पर उच्च throughput डेटा की पीढ़ी के लिए कुशल साबित कर दी है, प्रयोगात्मक इलाज किया और आनुवंशिक रूप से संशोधित भ्रूण और ESCs 5-7। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम preimplantation चरण भ्रूण छवियों के विभाजन मिनट के आवेदन का वर्णन है। ESCs पर मिनट प्रदर्शन के उदाहरण के लिए 4,7 देखें। स्वचालित परमाणु विभाजन कदम काफी, सेल पहचान की प्रक्रिया के समय बोझ कम कर देता है, जबकि स्थानिक और प्रतिदीप्ति तीव्रता माप भ्रूण में सेल पहचान के लिए एक निष्पक्ष दृढ़ संकल्प और जीन अभिव्यक्ति डोमेन और सेल की स्थिति के तीन आयामी नक्शे की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं (चित्रा 1C </strong>)। इसके अलावा, इस कार्यप्रवाह के scalability यह प्रयोगात्मक इलाज भ्रूण, या विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि 5,6 के भ्रूण की बड़ी साथियों के माध्यम से अलग-अलग litters के विश्लेषण के लिए लागू करता है। मिनट (सॉफ्टवेयर एक MATLAB लाइसेंस की आवश्यकता है) http://katlab-tools.org पर आसानी से उपलब्ध है।
कोई दृष्टिकोण की तारीख करने के लिए विकसित प्रोटीन अभिव्यक्ति और माउस preimplantation भ्रूण में सेल स्थानीयकरण पर ऐसे में गहराई से डेटा की पीढ़ी की अनुमति देता है। सभी प्रयास इस प्रकार अब तक के आंकड़ों के इन प्रकार बढ़ाता पर भ्रूण में मैनुअल दृढ़ संकल्प और विभिन्न आबादी के लिए सेल नंबर के quantitation (या तो पूरी तरह से मैन्युअल, या सॉफ्टवेयर की मदद से) 9-19 के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। यह दृष्टिकोण (मिनट सॉफ्टवेयर को शामिल) के लिए रुझान और माउस preimplantation भ्रूण और ESCs पर परीक्षण किया गया है; फिर भी, उच्च घनत्व के साथ परमाणु अन्य प्रणालियों पर अपने प्रदर्शन हालांकि अभी तक अपरीक्षित, बराबर होने की उम्मीद है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल preimplantation चरण माउस भ्रूण पर पूरे माउंट immunofluorescence का एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक मजबूत इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 22 उच्च संकल्प द्वारा पीछा किया जाता ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
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