Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni
Summary
Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.
Abstract
Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, monocellulari in situ analisi dell'espressione della proteina per studiare specifica lineage in embrioni di topo preimpianto. sono descritte le procedure necessarie per la raccolta degli embrioni, immunofluorescenza, imaging su un microscopio confocale, e la segmentazione di immagine e di analisi. Questo metodo consente la quantificazione dell'espressione dei diversi marcatori nucleari e spaziali (XYZ) coordina tutte le cellule nell'embrione. Si avvale di minuti, uno strumento software per la segmentazione di immagini appositamente sviluppato per l'analisi di immagini confocale di embrioni preimpianto e colonie di cellule staminali embrionali (ESC). MINS svolge segmentazione nucleare senza supervisione di tutti i X, Y e Z dimensioni, e produce le informazioni sulla posizione della cella in uno spazio tridimensionale, così come i livelli di fluorescenza nucleari per tutti i canali con input dell'utente minima. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'analisi di immaginidi preimpianto embrioni fase di topo, può essere facilmente adattato per l'analisi di altri campioni che presentano un buon rapporto segnale-rumore e dove ad alta densità nucleare pone un ostacolo alla segmentazione dell'immagine (ad es., analisi di espressione di cellule staminali embrionali (ESC ) colonie, differenziando cellule in coltura, gli embrioni di altre specie o stadi, ecc.)
Introduction
L'embrione di topo preimpianto è un paradigma per studiare la formazione e il mantenimento della pluripotenza in vivo, così come un modello per lo studio della determinazione del fato cellulare e de novo epitelizzazione nei mammiferi. Le fasi preimpianto dello sviluppo dei mammiferi sono dedicati alla creazione di tre linee cellulari che compongono la blastocisti, vale a dire la epiblasto pluripotente – che dà luogo alla maggior parte dei tessuti somatici e le cellule germinali – e due linee extraembrionali, il trophectoderm (TE) e la endoderma primitivo (PRE) (Figura 1A) 1,2. Questo protocollo descrive le procedure per (1) embrioni raccolta e fissare fase preimpianto del mouse, (2) eseguire immunofluorescenza per etichettare le proteine di interesse, (3) effettuare tutto il montaggio di immagini utilizzando un microscopio confocale con funzionalità di z-sezionamento e (4) eseguire la segmentazione nucleare di immagini confocale e analisi successive immagine quantitativa. Questo gasdotto permette tegli imparziali misurazione dei livelli di proteine per l'assegnazione delle identità cellulari per caratterizzare le sottopopolazioni di cellule in situ. Questo protocollo può essere eseguito in meno di 3 – 4 giorni per una singola cucciolata (generalmente fino a 10 embrioni di topo), dalla raccolta embrione per l'analisi dei dati (Figura 1B). L'analisi simultanea di più cucciolate aumenterebbe l'imaging e analisi di dati in tempo onere, estendendo così la lunghezza complessiva del protocollo.
L'embrione preimpianto fase del mouse è un sistema sperimentale trattabili che, data la sua piccola dimensione e morfologia stereotipata 3, è adatto per l'imaging in toto di processi cellulari con risoluzione di una singola cellula. Per effettuare un imparziale, analisi a livello di sistema di un numero statisticamente rilevante di embrioni, un sistema automatico, pipeline di analisi quantitativa è desiderabile. Tuttavia, a causa della elevata densità nucleare della massa cellulare interna (ICM) della blastocisti ( <strong> Figura 1A, 2D), piattaforme immagine segmentazione convenzionali non riescono a fornire una sufficiente precisione per stabilire un flusso di lavoro automatizzato o semi-automatizzato. D'altra parte, la segmentazione manuale, mentre accurate, non consente l'elaborazione di grandi coorti di cellule ed embrioni, né è adeguato riproducibile, determinazione imparziale delle identità cellulari – che è particolarmente importante quando si studiano stadi di sviluppo in cui i modelli di marcatore espressione non ha completamente risolto (ad esempio, non presentano una distribuzione binaria in una popolazione). Abbiamo recentemente sviluppato e validato un metodo di segmentazione delle immagini su misura per gli embrioni palco del mouse preimpianto e per le cellule staminali embrionali di topo (CES), che raggiunge un'elevata accuratezza, mentre richiede un input minimo dell'utente 4-8.
Il gasdotto analisi presentata qui ruota attorno lo strumento segmentazione delle immagini MATLAB a base modulare interattivo Segmentazione Nucleare (minuti) 4. MIN performs segmentazione nucleare senza supervisione su grandi lotti di confocale Z-stack dopo che l'utente ha stabilito un numero minimo di proprietà dell'immagine, utilizzando un'interfaccia utente grafica (GUI) (Tabella 1) 4. Questo oleodotto si è dimostrato efficace per la generazione di dati ad alto rendimento sulla espressione di proteine e localizzazione cellulare in entrambi wild-type, sperimentalmente trattati e gli embrioni e CES 5-7 geneticamente modificati. Nel presente protocollo, si descrive l'applicazione di minuti alla segmentazione di immagini dell'embrione preimpianto stadio. Per esempi di prestazioni minuti sul CES si rimanda al 4,7. La fase di segmentazione nucleare automatizzato riduce notevolmente l'onere tempo del processo di identificazione delle cellule, mentre le misure di intensità spaziale e fluorescenza consentono una determinazione imparziale delle identità delle cellule e la generazione di mappe tridimensionali di domini di espressione genica e la posizione delle cellule nell'embrione (Figura 1C </strong>). Inoltre, la scalabilità di questo flusso di lavoro rende applicabile all'analisi dei singoli cucciolate attraverso grandi coorti di embrioni trattati sperimentalmente, o embrioni di diverso background genetico 5,6. Minuti è liberamente disponibile presso http://katlab-tools.org (il software richiede una licenza MATLAB).
Nessun approccio sviluppato fino ad oggi consente la generazione di tali dati in modo approfondito l'espressione proteica e la localizzazione delle cellule in embrioni di topo preimpianto. Tutti i tentativi finora a quantificare questi tipi di dati sono stati limitati alla determinazione manuale e quantificare la presenza di numeri di cellulare per le diverse popolazioni nell'embrione (o interamente a mano, o software-assistita) 9-19. Questo approccio (che incorpora il software minuti) è stata adattata per e testato su embrioni preimpianto mouse e CES; tuttavia la sua prestazione su altri sistemi con elevata densità nucleare, anche se ancora sottoposti a verifica, dovrebbe essere equivalente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo per eseguire un'analisi quantitativa di tutto il montaggio immunofluorescenza su preimpianto degli embrioni palco del mouse. Un robusto protocollo di immunofluorescenza 22 è seguito da ad alta risoluzione, tutto il montaggio confocale e dalla segmentazione delle immagini utilizzando un pezzo su misura del software 4. Mentre la scelta del protocollo immunofluorescenza non è critica, troviamo quello qui presentato 22 per essere veloce, affida…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
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