マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析
Summary
このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。
Abstract
このプロトコルは、系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のインサイチュ分析で定量、単セルを実行するための方法を提供 マウスの着床前胚インチ胚コレクション、免疫蛍光、共焦点顕微鏡で画像化し、画像分割および分析のために必要な手順が記載されています。この方法は、複数の核マーカーの発現と空間胚内のすべてのセルの（XYZ）座標の定量を可能にします。それはMINS、特に着床前胚および胚性幹細胞（ESC）のコロニーの共焦点画像の解析のために開発された画像セグメンテーションのソフトウェアツールを利用しています。 MINSはX、YおよびZ次元を横切る教師なし核セグメンテーションを行い、最小限のユーザ入力で、すべてのチャンネルについて、三次元空間内のセルの位置情報、ならびに核蛍光レベルを生成します。このプロトコルは、画像の解析のために最適化されているが着床前段階のマウス胚の、容易に良好な信号対雑音比を示す任意の他のサンプルの分析に適合し、ここで、高核密度は、画像分割（ 例えば 、胚性幹細胞（ESCの発現解析に障害をもたらすことができます）コロニーを、培養物中の細胞を分化、他の種または段階の胚、 等 ）。
Introduction
マウスの着床前胚は、細胞の運命の仕様および哺乳動物におけるデノボ上皮の研究のための出現とin vivoでの多能性の維持だけでなく、モデルを研究するためのパラダイムです。そして2胚体外系統、栄養外胚葉（TE）と – ほとんどの体細胞組織と生殖細胞を生じさせる – 哺乳類の発生の着床前段階は胚盤胞、すなわち多能性胚盤葉上層を構成する3つの細胞系統の確立に専念しています原始内胚葉（PRE）（ 図1A）1,2。このプロトコルは、（1）収穫に手順を説明し、着床前段階のマウス胚を固定し、（2）目的のタンパク質を標識するために免疫蛍光を行う、（3）のzセクショニング機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて全マウントイメージングを行い、（4）共焦点画像とその後の定量的画像分析の核セグメンテーションを行います。このパイプラインは、トンを可能にします彼は、 その場での細胞の亜集団を特徴づけるために、セルIDの割り当てのためのタンパク質レベルの測定に公正。データ解析（ 図1B）に胚コレクションから、（一般的に10マウス胚まで）単一のごみのために4日-このプロトコルはわずか3で行うことができます。いくつかの同腹仔の同時分析は、このように、プロトコルの全体の長さを延長する、画像化およびデータ分析の時間負担を増加させます。
着床前段階のマウス胚は、その小さなサイズとステレオタイプの形態3与えられた、実験的に扱いやすいシステムであり、単一セルの解像度を持つ細胞プロセスのトト撮影に適しています。胚の統計学的に関連する多数の公平な、システムレベルの分析を行うために、自動化され、定量分析パイプラインが望ましいです。しかし、胚盤胞の内部細胞塊（ICM）（高核密度に起因<st栄>図1A、図2D）、従来の画像分割プラットフォームは、自動化または半自動化されたワークフローを確立するために十分な精度が得られません。一方、マニュアルセグメンテーションは、正確な一方で、細胞や胚の大コホートの処理を許可していません。また、セルアイデンティティの再現性、公平な決意するのに適している – 発達段階を研究する際に特に重要であるマーカーのパターン式は完全に（ 例えば 、人口全体のバイナリディストリビューションを示さない）解決しません。最近開発され、最小限のユーザ入力4-8を必要としつつ、高精度を実現マウス着床前段階の胚およびマウス胚性幹細胞（ESC）に合わせた画像分割方法を検証しています。
ここで紹介する解析パイプラインは、MATLABベースの画像分割ツールモジュラー対話型原子力セグメンテーション（MINS）4を中心に展開。 MINS Pユーザは、グラフィカル・ユーザー・インターフェース（GUI）（ 表1）4 を使用して 、画像特性の最小数を確立した後、共焦点のZスタックの大きなバッチの教師なし核セグメンテーションをerforms。このパイプラインは、野生型、実験的に処理し、遺伝的に改変された胚とのESC 5-7の両方でタンパク質の発現および細胞局在化の高スループットデータの生成のために効率的であることが証明されました。現在のプロトコルでは、我々は、着床前段階の胚の画像のセグメンテーションにMINSのアプリケーションを記述します。 ESCの上MINS性能の例については4.7を参照してください。空間的な蛍光強度の測定は、セル識別情報の公正な決意胚（ 図中の遺伝子発現ドメイン及び細胞位置の三次元マップの生成を可能にする一方、自動化された核のセグメント化ステップが大きく、セル識別プロセスの時間の負担を軽減1C </strong>）。また、このワークフローの拡張性は、実験的に処理された胚の大コホートを通じて個々リットルの分析、または異なる遺伝的背景5,6の胚にそれが適用になります。 MINSは（ソフトウェアは、MATLABのライセンスが必要）http://katlab-tools.orgで自由に利用可能です。
今日までに開発なしのアプローチは、マウスの着床前胚におけるタンパク質発現および細胞局在化に対するこのような綿密なデータの生成を可能にしません。すべての試みはこれまでに、これらのタイプのデータを定量化で9月19日 （いずれか完全に手動で、またはソフトウェアアシスト）胚における異なる集団のために細胞数のマニュアル決意および定量に制限されています。 （MINSソフトウェアを組み込んだ）このアプローチは、に合わせ、マウスの着床前胚およびESCの上でテストされています。それにもかかわらず、高核密度を有する他のシステムでは、その性能は、まだテストされていないが、同等であると予想されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルは、着床前段階のマウス胚の全マウント免疫蛍光の定量的な分析を実行する方法について説明します。堅牢な免疫蛍光プロトコル22は、高解像度、ホールマウント共焦点イメージングによっておよびソフトウェア4の仕立て片を用いて画像分割が続いています。免疫蛍光プロトコルの選択は重要ではないが、我々は、高速で信頼性が高いことが、我々がテスト…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
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