Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer
Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å utføre kvantitativ, enkelt-celle in situ analyse av protein ekspresjon for å studere avstamning spesifikasjon i mus preimplantation embryoer. De prosedyrer som er nødvendige for innsamling av blastocyster, hel-mount immunofluorescent påvisning av proteiner, avbildning av prøvene på en konfokalmikroskop, og kjernefysisk segmentering og bildeanalyse er beskrevet.
Abstract
Denne protokollen presenterer en metode for å utføre kvantitativ, enkelt-celle in situ analyser av protein uttrykk for å studere avstamning spesifikasjon i mus preimplantation embryoer. De prosedyrer som er nødvendige for embryo samling, immunfluorescens, bildebehandling på en konfokalmikroskop og bilde segmentering og analyse er beskrevet. Denne metoden tillater kvantifisering av ekspresjon av multiple markører atom og den romlige (XYZ) koordinerer av alle celler i embryo. Det tar nytte av MINUTTER, et bilde segmentering verktøy spesielt utviklet for analyse av confocal bilder av preimplantation embryoer og embryonale stamcelle (ESC) kolonier. MINUTTER utfører uten tilsyn atom segmentering på tvers av X, Y og Z dimensjoner, og gir informasjon om posisjon celle i tre-dimensjonale rommet, så vel som kjernefysiske fluorescens-nivåer for alle kanaler med minimal brukerundersøkelser. Mens denne protokollen er optimalisert for analyse av bilderav preimplantation stadium mus embryo, kan det lett tilpasses til analyse av eventuelle andre prøver som oppviser en god signal-til-støy-forhold og hvor høy atom tetthet utgjør et hinder for å bilde segmentering (f.eks., ekspresjon analyse av embryonale stamceller (ESC ) kolonier, differensierende celler i kultur, embryoer av andre arter eller stadier, etc.).
Introduction
Musen preimplantation embryo er et paradigme for å studere veksten og vedlikehold av pluripotency in vivo, så vel som en modell for studiet av cellen skjebne beskrivelsen og de novo epithelialization i pattedyr. Preimplantasjonsperioden stadier av pattedyr utvikling er dedikert til etablering av de tre celle linjene som utgjør blastocyst, nemlig pluripotent epiblast – som gir opphav til de fleste somatiske vev og kjønnsceller – og to extraembryonic slektsnavn, det trophectoderm (TE) og primitive endoderm (pre) (figur 1A) 1,2. Denne protokollen beskriver prosedyrer til (1) høsting og fikse preimplantation scenen museembryoer, (2) utføre immunfluorescens å merke proteiner av interesse, (3) gjennomføre hel-mount bildebehandling ved hjelp av en konfokalmikroskop med z-seksjonering evner og (4) utføre atom segmentering av confocal bilder og påfølgende kvantitativ bildeanalyse. Denne rørledningen kan than objektive målinger av proteinnivåer for tildeling av celle identiteter for å karakterisere subpopulasjoner av celler in situ. Denne protokollen kan utføres på så lite som 3 – 4 dager for en enkelt kull (vanligvis opp til 10 mus embryo), fra embryo samling til dataanalyse (figur 1B). Den samtidige analyse av flere kull ville øke avbildnings og dataanalyse tid belastning, og dermed forlenge den totale lengde av protokollen.
Preimplantasjonsperioden scenen museembryo er et eksperimentelt medgjørlig system som, gitt sin lille størrelse og stereotype morfologi 3, er godt egnet for i toto avbildning av cellulære prosesser med encellede oppløsning. For å gjennomføre en objektiv, systemer-nivå analyse av et statistisk relevant antall embryoer, er en automatisk, kvantitativ analyse rørledning ønskelig. Men på grunn av den høye atomtettheten av den indre cellemasse (ICM) av blastocysten ( <strong> Figur 1A, 2D), vanlige bildesegmenterings plattformer unnlater å gi tilstrekkelig nøyaktighet for å etablere en automatisert eller semi-automatisert arbeidsflyt. På den annen side, manuell segmentering, mens nøyaktig, tillater ikke behandling av store kohorter av celler og embryoer, det er heller ikke egnet for en reproduserbar, objektiv måling av celle identiteter – som er spesielt kritisk når studere utviklingsstadier hvor mønstre av markør uttrykket har ikke helt løst (f.eks, ikke viser en binær-distribusjon på tvers av en befolkning). Vi har nylig utviklet og validert et bilde segmentering metoden skreddersydd for mus preimplantation scene embryoer og for mus embryonale stamceller (ESCs) som oppnår høy nøyaktighet, mens det krever minimal brukerundersøkelser 4-8.
Analysen rørledning presenteres her dreier seg om MATLAB-baserte bildesegmentering verktøy Modular Interactive Nuclear Segmentering (min) 4. MINUTTER performs unsupervised atom segmentering på store grupper av confocal Z-stabler etter at brukeren har etablert et minimalt antall bildeegenskapene, ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI) (tabell 1) 4. Denne rørledning har vist seg effektiv for generering av data med høy gjennomstrømning på protein ekspresjon og celle lokalisering i både villtype, eksperimentelt behandlede og genetisk modifisert embryoer og ESCs 5-7. I den foreliggende protokollen beskriver vi bruk av minutter til segmentering av preimplantation-trinns embryo bilder. For eksempler på MINUTTER ytelse på ESCs henvises det til 4,7. Den automatiserte atom segmentering trinn reduserer tiden byrden av celleidentifikasjonsprosessen, mens de romlige og fluorescens intensitetsmålinger gi en objektiv bestemmelse av celle identiteter og generering av tre-dimensjonale kart av genekspresjon domener og celleposisjon i embryoet (figur 1C </strong>). Videre skalerbarheten av denne arbeidsflyten gjør det aktuelt for analyse av enkelt kull gjennom store årskull av eksperimentelt behandlet embryoer eller embryoer fra ulike genetiske bakgrunn 5,6. MINUTTER er fritt tilgjengelig på http://katlab-tools.org (programvaren krever en MATLAB lisens).
Ingen tilnærming utviklet til dags dato tillater generering av slike data i dybden på protein uttrykk og celle lokalisering i mus preimplantation embryoer. Alle forsøk hittil på å kvantifisere denne type data er begrenset til den manuelle besluttsomhet og kvantifisering av celle tall for ulike populasjoner i embryoet (enten helt manuelt, eller software-assistert) 9-19. Denne tilnærmingen (som omfatter MINUTTER programvare) har blitt skreddersydd for og testet på mus preimplantation befruktede egg og ESCs; likevel sin ytelse på andre systemer med høy kjernetetthet, men ennå ikke testet, er ventet å være tilsvarende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å utføre en kvantitativ analyse av hel-mount immunfluorescens på preimplantation scenen museembryoer. En robust immunfluorescens protokoll 22 er etterfulgt av høy oppløsning, hel-mount confocal bildebehandling og etter bilde segmentering hjelp av en skreddersydd stykke programvare 4. Mens valget av immunofluorescens-protokollen er ikke kritisk, finner vi den som presenteres her 22 for å være rask, pålitelig og for å tilveiebrin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
