Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için
Summary
Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.
Abstract
Bu protokol, bir yöntem olup sayısal gerçekleştirmek için sunulur, yerinde tek hücre hattı özellikleri çalışma protein ekspresyonu analizi Fare preimplantasyon embriyolarında. Embriyo toplama, immünofloresans, bir konfokal mikroskop görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ve analiz için gerekli işlemler anlatılmaktadır. Bu yöntem, çoklu nükleer belirteçler ifade ve mekansal (XYZ) ve niceleme embriyo tüm hücrelerin koordinatları verir. Bu DAKİKA, özellikle preimplantasyon embriyo ve embriyonik kök hücre (ESC) kolonilerin konfokal görüntülerin analizi için geliştirilmiş bir görüntü bölütleme yazılım aracı yararlanır. MINS X, Y ve Z boyutları arasında denetimsiz nükleer segmentasyonu yürütmektedir ve az kullanıcı girişi ile tüm kanallar için üç boyutlu uzayda hücre konumuna ilişkin bilgiler, yanı sıra nükleer floresan seviyeleri üretir. Bu protokol, görüntü analizi için optimize edilmiş olsa dapreimplantasyon sahne fare embriyoları, kolayca iyi bir sinyal-gürültü oranı ve nerede yüksek nükleer yoğunluk (görüntü segmentasyonu bir engel teşkil örn., embriyonik kök hücre ifade analizini gösteren başka örneklerin analizi (ESC adapte edilebilir ) koloniler, kültür hücreleri, diğer türleri veya aşamaları, vb) arasında embriyolar ayırt.
Introduction
Fare preimplantasyon embriyo hücresi kaderi tarifnamede ve memelilerde de-novo epitelizasyonu çalışma için ortaya çıkışı ve in vivo pluripotensin idamesinde, hem de bir model çalışma için bir örnektir. ve iki extraembryonic soy, trofoektoderm (TE) ve – en somatik doku ve germ hücreleri yol açmaktadır – memeli gelişim preimplantasyon aşamaları blastosist, yani pluripotent epiblast oluşturan üç hücre soylarının kurulması için varız ilkel endoderm (PrE) (Şekil 1A) 1,2. Bu protokol, (2), ilgilenilen proteinleri etiket immünofloresan gerçekleştirmek (3) z-kesit yetenekleri ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme monte tam yürütmek (1) hasat ve düzeltmek preimplantasyon sahne fare embriyoları prosedürleri açıklamaktadır (4) konfokal görüntüleri ve sonraki kantitatif görüntü analizleri nükleer segmentasyon gerçekleştirin. Bu boru hattı t veriyorO yerinde hücrelerin subpopülasyonunun karakterize hücre kimliklerin atama için protein düzeylerinin ölçülmesi tarafsız. Veri analizi (Şekil 1B) embriyo toplama, (genellikle 10 fare embriyoları kadar) tek bir çöp için 4 gün – Bu protokol az 3 olarak yapılabilir. Birkaç litre eşzamanlı analizi böylelikle protokol genel uzunluğu boyunca uzanan, görüntüleme ve veri analizi zaman yükünü artıracaktır.
Preimplantasyon sahne fare embriyosu kendi küçük boyutlu ve basmakalıp morfoloji 3 verilen tek hücreli çözünürlüğe sahip hücresel süreçlerin toto görüntüleme için çok uygundur, bir deneysel uysal bir sistemdir. Embriyoların istatistiksel ilgili sayısının tarafsız, sistem düzeyinde analiz yürütmek için, otomatik, kantitatif analiz boru hattı arzu edilir. Ancak, iç hücre kütlesinden yüksek nükleer yoğunluk blastosist (ICM) nedeniyle ( <stRong> Şekil 1A, 2B), geleneksel görüntü bölümleme platformları otomatik veya yarı otomatik iş akışı oluşturmak için yeterli doğruluk sağlamak için başarısız. Öte yandan, manuel segmentasyon, doğru ise, hücrelerin ve embriyoların büyük kohort işleme izin vermez, ne de hücre kimliklerin bir tekrarlanabilir, tarafsız tayini için uygundur – gelişim aşamalarını inceleyerek özellikle önemli olduğu marker desenleri ifadesi tamamen (örneğin, nüfusu karşısında ikili bir dağılım göstermezler) çözülmüş değil. En az kullanıcı girişi 4-8 gerektiren Biz son zamanlarda, fare preimplantasyon sahne embriyolar için ve yüksek doğruluk elde fare embriyonik kök hücreleri (EKH) için özel bir görüntü segmentasyonu yöntem geliştirdi ve onaylamıştır.
Burada sunulan analiz boru hattı MATLAB tabanlı görüntü bölütleme aracı Modüler İnteraktif Nükleer segmentasyon (DAK) 4 etrafında döner. MINS pKullanıcı bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) (Tablo 1) 4 kullanılarak, görüntü özellikleri az sayıda kurmuştur sonra konfokal Z-yığınlarının büyük gruplar üzerinde denetimsiz nükleer segmentasyon erforms. Bu boru hattı, hem vahşi tip protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu yüksek kapasiteli veri üretimi için verimli olduğu kanıtlanmıştır, deneysel tedavi ve genetik embriyolar ve EKH 5-7 güncellenmiştir. Mevcut protokol, preimplantasyon aşamalı embriyo görüntüleri segmentasyonuna DAKİKA uygulanmasını açıklar. EKH üzerinde MINS performans örnekleri için 4,7 bakınız. Otomatik nükleer segmentasyon adım ölçüde, mekansal ve floresan yoğunluğu ölçümleri embriyoda hücre kimliklerin tarafsız bir kararlılık ve gen ifadesi etki ve hücre pozisyonunun üç boyutlu haritalarının oluşturulmasına izin oysa (Şekil hücre tanımlaması sürecinin zaman yükünü azaltır 1C </strong>). Dahası, bu iş akışının ölçeklenebilirlik deneysel tedavi embriyolar ya da farklı genetik geçmişleri 5,6 embriyoların büyük kohortlar aracılığıyla bireysel litre analizine de uygulanabilir hale getirir. DAK (yazılım MATLAB lisans gerektirir) http://katlab-tools.org de serbestçe kullanılabilir.
Bugüne kadar geliştirilen hiçbir yaklaşım fare preimplantasyon embriyolar protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu gibi derinlemesine veri üretimi sağlar. Tüm girişimleri bugüne kadar bu tür verileri miktarının manuel belirlenmesi ve farklı popülasyonlar için hücre sayıları kantitatif embriyoda (ya tamamen elle veya yazılım destekli) 9-19 sınırlı olmuştur. (DAK yazılımını içeren) Bu yaklaşım için özel ve fare preimplantasyon embriyoları ve EKH üzerinde test edilmiştir; yine yüksek nükleer yoğunluklu diğer sistemlerde performansı, henüz denenmemiş olsa da, eşdeğer olması bekleniyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol preimplantasyon sahne fare embriyoları üzerinde tüm montaj Immünofloresan bir nicel analizini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanır. Sağlam immünofloresan protokolü 22 yüksek çözünürlüklü takip eder, yazılımın 4 uyarlanmış bir parçası kullanarak konfokal görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ile tüm montaj. Immünofloresan protokolünün seçimi kritik olmasa da, biz, hızlı, güvenilir olmak ve biz test ettik antikorların çoğu için güçl?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Riferimenti
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
