Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen
Summary
Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.
Abstract
De differentiatie mogelijkheden van pluripotente stamcellen zoals embryonale stamcellen (SER) maken voor een potentiële therapeutische toepassing voor celvervangingstherapieën. Terminaal gedifferentieerde celtypen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In vitro differentiatie van deze cellen aan weefsels van de longen, lever en pancreas vereist in de eerste stap het genereren van definitieve endodermale cellen. Deze stap is snelheidsbepalend voor verdere differentiatie richting terminaal rijpte celtypes zoals insuline producerende beta-cellen, hepatocyten of andere endoderm afgeleide celtypen. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming sterk drukken een veelheid van transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA, en het oppervlak receptor CXCR4. Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt. Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van een CXCR4 + celpopulatie na differentiatiein het voorste via magnetische microkralen. Deze zuivering bovendien verwijdert cellen ongewenste lijnen. De zachte reiniging methode is snel en betrouwbaar en kunnen worden gebruikt om downstream-toepassingen en differentiaties te verbeteren.
Introduction
Pluripotente cellen zoals embryonale stamcellen (SER) hebben de mogelijkheid om te differentiëren in vrijwel elk type cel van het menselijk lichaam. Aldus kan in vitro differentiatie protocollen worden gebruikt om verschillende volwassen celtypes zoals cardiomyocyten 1, hepatocyten 2, 3 beta-cellen, long epitheelcellen 4 of 5 neuronale cellen te genereren. Dit maakt SER een waardevol instrument voor de mogelijke behandeling van verschillende degeneratieve ziekten 3.
De in vitro differentiatie van SER richting volwassen weefsels van de longen, lever en pancreas is een pseudo-gastrulatie in cellen die doet denken aan de definitieve endoderm (DE) 6. Aangezien stroomafwaarts differentiatie naar de genoemde somatische celtypen aanzienlijk minder efficiënt wordt een optimale endoderm differentiatie geacht snelheidsbepalende 7. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming ondergaan characteristic veranderingen in hun expressie van genen profiel. Pluripotentie meester regulator genen worden naar beneden gereguleerd, terwijl de expressie van andere transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA en het oppervlak receptor CXCR4 is sterk opgereguleerd 6, 8, 9. CXCR4 is bekend dat transactivated door SMAD2 / 3, stroomafwaarts van Nodal / TGF-β signalering en Sox17 gevolg van specifieke bindingsplaatsen in het promotorgebied 10. Aldus is een zeer geschikte marker gebruikt in een aantal rapporten 6, 8, 11-13. Deze uitdrukking veranderingen weerspiegelt een pseudo-gastrulatie event, waarbij SER eerste kenmerken van een primitieve streep-achtige celpopulatie te verwerven en vervolgens te plegen in de kiem endoderm laag 6.
Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt als enkele cellen het differentiatieproces kan weerstaan of differentiëren tot andere ongewenste lijnen 14. Deze cellen kunnen negatief Influenvu verdere differentiatie. Bovendien resterende ongedifferentieerde cellen herbergen grote risico's voor later transplantatie experimenten en kan aanleiding geven tot teratomas 15-17 te geven.
Om deze ongewenste cellen vroeg op het oppervlak marker CXCR4 kan worden gebruikt voor het zuiveren van cellen die zijn toegewijd aan het voorste 18 verwijderen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de positieve selectie van CXCR4 + cellen uit DE differentiatie culturen. Hierbij wordt het oppervlak marker CXCR4 gebonden door een antilichaam dat dan op zijn beurt bindt aan magnetische microkralen. Anders dan de zware omstandigheden tijdens FACS-sortering, de magnetisch gemerkte DE-achtige cellen kunnen vervolgens eenvoudig worden gezuiverd in een benchtop formaat met behulp van een zachte zuiveringswerkwijze. Dit protocol verschaft een eenvoudige werkwijze voor het verwijderen van celpopulaties die het voorste differentiatieproces tegengegaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op dit moment gebruikt differentiatie protocollen zelden tot 100% gedifferentieerde cellen. Om redenen die nog moeten worden aangepakt sommige cellen weerstaan aan de differentiatie proces. Afhankelijk van de efficiëntie van de gebruikte differentiatie protocol en de neiging van het ESC lijn een aantal residuele pluripotente cellen worden vaak waargenomen, zelfs na differentiatie in de definitieve endoderm. Deze resterende cellen kunnen stroomafwaarts differentiaties of verdere analyse, zoals transcriptomics, pro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De bekwame technische bijstand van Jasmin Kresse is dankbaar erkend.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
Riferimenti
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P.W., Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P.M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet? Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D'Amour, K.A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P.T., Ong, C.J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M.C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J.E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S.J., Zhou, G.D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W.J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P.L., Wang, S.T., Phillips, B.W., Putti, T.C., Dunn, N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C.A., Kwa, M.S., Hermsen, H.P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W.H., Baker, J.C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), e17536 (2011).
