Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane
Summary
Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l'endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.
Abstract
Le capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) permettono una potenziale applicazione terapeutica per le terapie di sostituzione cellulare. Terminally tipi di cellule differenziate potrebbero essere utilizzati per il trattamento di varie malattie degenerative. In vitro differenziazione di queste cellule verso tessuti del polmone, fegato e pancreas richiede come primo passo la generazione di cellule endodermico definitive. Questo passaggio è limitante per un'ulteriore differenziazione verso tipi di cellule terminalmente maturate come le cellule beta produttrici di insulina, epatociti o altri tipi di cellule endoderma-derivati. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma altamente esprimono una moltitudine di fattori di trascrizione come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA, e il recettore CXCR4 superficiale. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100%. Qui, si descrive un metodo per la purificazione di una popolazione di cellule CXCR4 + dopo la differenziazionenella DE utilizzando microsfere magnetiche. Questa purificazione elimina inoltre le cellule di linee indesiderate. Il metodo di purificazione delicata è veloce e affidabile e può essere utilizzata per migliorare le applicazioni a valle e differenziazioni.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano. Così, in vitro protocolli di differenziazione possono essere utilizzati per generare numerosi tipi cellulari adulto come cardiomiociti 1, epatociti 2, cellule beta 3, epiteliale polmonare 4 o cellule neuronali 5. Questo rende CES uno strumento prezioso per il potenziale trattamento di diverse malattie degenerative 3.
La differenziazione in vitro dei CES verso tessuti adulti del polmone, del fegato e del pancreas richiede una pseudo-gastrulazione in cellule che ricordano l'endoderma definitivo (DE) 6. Poiché differenziazione valle verso i suddetti tipi di cellule somatiche è molto meno efficienti, una differenziazione endoderma ottimale è considerata limitante 7. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma subiscono chacambiamenti racteristic nel loro profilo di espressione genica. Maestri pluripotenza geni regolatori sono giù regolati, mentre l'espressione di altri fattori di trascrizione, come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA e il recettore di superficie CXCR4 è altamente upregulated 6, 8, 9. CXCR4 è noto per essere transactivated da SMAD2 / 3, a valle della nodale di segnalazione / TGF-β e SOX17 a causa di specifici siti di legame nella sua regione del promotore 10. Così è un marcatore molto adatto utilizzato in una serie di relazioni 6, 8, 11-13. Questi cambiamenti di espressione riflette un evento di pseudo-gastrulazione, in cui i CES prima acquisire caratteristiche di una popolazione di cellule striscia simile primitiva e, successivamente, si impegnano nello strato germinale endoderma 6.
Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100% come poche cellule possono resistere al processo di differenziazione o differenziare verso altre linee non intenzionali 14. Queste cellule possono Influe negativamentence ulteriore differenziazione. Inoltre, le cellule indifferenziate residue porto grandi rischi per i successivi esperimenti di trapianto e possono dar luogo a teratomi 15-17.
Per rimuovere queste cellule indesiderate precoce sul marcatore CXCR4 superficie può essere utilizzato per la purificazione di cellule che si sono impegnati verso la DE 18. Qui, descriviamo un metodo per la selezione positiva di + cellule CXCR4 da De culture differenziazione. Per questo, il marcatore CXCR4 superficie è vincolato da un anticorpo che poi a sua volta si lega a microsfere magnetiche. A differenza delle dure condizioni durante FACS ordinamento, le cellule DE-come magneticamente etichettati possono quindi facilmente essere purificati in un formato da banco utilizzando un metodo di purificazione delicato. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per la rimozione delle popolazioni cellulari che oppone il processo di differenziazione DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
protocolli di differenziazione Attualmente utilizzati raramente si traducono in 100% di cellule differenziate. Per ragioni che devono ancora essere affrontate alcune cellule resistono il processo di differenziazione. A seconda della efficienza del protocollo differenziazione utilizzato e la propensione del CES linea un certo numero di cellule pluripotenti residue vengono comunemente osservato anche dopo differenziamento in endoderma definitiva. Queste cellule residue possono compromettere differenziazioni a valle o ulte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'assistenza tecnica abile di Jasmin Kresse è riconosciuto con gratitudine.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
Riferimenti
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