ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法
Summary
ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。
Abstract
このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞の分化能力は、細胞置換療法のための潜在的治療用途を可能にします。分化した細胞型は、種々の変性疾患の治療のために使用することができる。、肺、肝臓、および膵臓の組織に向かって、これらの細胞のインビトロ分化は、第一段階として、決定的な内胚葉細胞の生成を必要とします。このステップは、レート制限などのインスリン産生β細胞、肝細胞または他の内胚葉由来の細胞型として末端成熟した細胞型に向けてさらなる分化のためのものです。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、非常にそのようなFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバー、および表面受容体CXCR4のような転写因子の多くを表現します。しかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。ここでは、分化後のCXCR4 +細胞集団の精製のための方法を説明します磁性マイクロビーズを使用して、DEへ。この精製は、さらに不要な系統の細胞を除去します。穏やかな精製方法は、迅速で信頼性が高く、下流側のアプリケーションと分化を改善するために使用されるかもしれません。
Introduction
このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞は、ヒトの身体の実質的に任意の細胞型に分化する能力を有します。したがって、in vitroでの分化プロトコルは、心筋1、肝細胞2、β細胞3、肺上皮4または神経細胞5のような多数の成体細胞型を生成することができます。これは、様々な変性疾患3の潜在的な治療のためのESCの貴重なツールとなります。
肺、肝臓と膵臓の成体組織に向かってESCのインビトロ分化は、胚体内胚葉（DE）6を連想させる細胞への擬似原腸形成を必要とします。上記の体細胞型に向かって下流分化は著しく効率が低いので、最適な内胚葉分化は律速7とみなされます。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、茶を受けますそれらの遺伝子発現プロファイルのracteristic変化。例えばFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバーと表面受容体CXCR4のような他の転写因子の発現は非常6、8、9を上方制御される一方、多能性マスター調節遺伝子がダウンレギュレートされている。CXCR4はSMAD2によりトランスされることが知られています、そのプロモーター領域10内の特定の結合部位へのノーダル/ TGF-βシグナルとSOX17の下流/ 3、。したがって、レポート6、8、11〜13の数で使用される非常に適したマーカーです。これらの発現変化のESCが第原始線条様細胞集団の特性を獲得し、その後、内胚葉の胚層6にコミットする擬似原腸形成のイベントを反映しています。
少数の細胞が分化過程をレジストや他の意図しない系統14に分化することができるようしかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。これらの細胞は、負influeありNCEさらなる分化。また、残余の未分化細胞は、後の移植実験のための大きなリスクを保有し、奇形腫15-17を生じさせる可能性があります。
早期に表面マーカーCXCR4 DE 18に向けてコミットされた細胞の精製に使用することができ、これらの不要な細胞を除去するために。ここでは、DE分化培養からのCXCR4 +細胞の正の選択のための方法を説明します。このため、表面マーカーCXCR4は、その後今度は、磁気マイクロビーズに結合する抗体によって結合されます。 FACS選別中過酷な条件とは異なり、磁気的に標識されたDE細胞様細胞は、その後、簡単に優しい精製法を用いて、ベンチトップ形式で精製され得ます。このプロトコルは、DE分化プロセスに抵抗する細胞集団を除去するための簡単な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在使用されて分化プロトコルはほとんど100％に分化した細胞になりません。まだ対処されなければならない理由のために、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗します。使用される分化プロトコルの効率とESCの傾向に応じて、残留多能性細胞の特定の数は、一般的にさえ胚体内胚葉への分化後に観察されているライン。これらの残留細胞は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジャスミンKresseの巧みな技術支援を深く感謝されています。
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
Riferimenti
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