유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 2 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 3 생활에 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 4를 대상으로한다.
세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히 저조한 이해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된 담즙산 또는 형광 담즙산 유사체의 사용을 모니터링한다. 후자는 아마도 자신의 특성에 영향을 미치는 담즙산의 수정을 필요로한다. 루시 페라 기반 기자는 가난한 시간 해상도를 가지고있다. 또한,이 기술은 시료의 손실이 발생할 및 단일 세포 이미징을위한 적용되지 않습니다. 따라서,이 비율 적 검출 5, 6의 장점을 포함하고, 특히 이후 FRET 바이오 센서를 이용하여 전송 활동의 실시간 단일 세포 이미징을 허용 방법을 사용하는 것이 유익 할 것이다. 반면 CF의 변형P / YFP 형태는 가장 자주 FRET 쌍, 적색 편이 담즙산 센서 (7)을 포함한 새로운 센서와 FRET 도구 상자의 확장을 주도 자기 협회 유발 돌연변이를 들고 mOrange 및 mCherry를 사용하여 새로운 전략을 사용했다.
우리는 이전에 farnesoid X 수용체 (FXR) 리간드 결합 도메인과 융합 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정)로 구성된 유전자 인코딩 FRET 담즙산 센서 (BAS)을 생성 (FXR-LBD) 및 펩티드 LXXLL 모티브 (8)를 포함. 담즙산 의존적으로 FXR-LBD이 펩티드 어소. FXR 활성화되면, 황수정과 하늘색 사이의 거리가 구조적 변화로 인해 변경됩니다. 포유 동물 세포주에서, 황 / 세룰 리안 비율 명확히 검출 가능한 증가 FXR 활성화 결과, 정제 된 센서는 반대 방향으로 작동하고 FXR 활성화시 FRET 비율 감소에 이르게한다. 이 센서 (CytoBAS)세포질 담즙산 역학의 모니터링을 할 수 있습니다. 세포 내 표적 모티프의 카복실 말단을 첨가하여, BAS 구조체는 다른 세포 구획에서 담즙산 농도의 측정을 허용하는, 핵 (NucleoBAS) 및 퍼 옥시 솜 (PeroxiBAS)을 타겟으로 할 수있다. 퍼 옥시 솜 타겟팅 모티브의 추가가 담즙산에의 대응 성을 손상하지 않지만, 세포 투과성 FXR – 리간드는이 퍼 옥시 솜 (8) 내부 PeroxiBAS의 변화를 FRET 유도하지 않았다. 이 차이의 특성을 알 수있는 바와 같이, 프로토콜은 다음과 CytoBAS NucleoBAS에 집중된다.
이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서의 사용은 최근 간 담즙산 수송 + / 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (NTCP) 나 유기 용질 수송 알파 / 베타 (OSTαβ)를 8 함유 세포에서 증명되었다. NTCP는 주 간 담즙산 수입하고 OSTαβ는 기저 장 담즙입니다전기 담즙산 농도 구배 (9), (10)에 따라 수입과 수출 모두 작동 할 수 있습니다 산 수송. 최근의 데이터는 NTCP 및 / 또는 OSTαβ 의한 담즙산 수송시 리간드 FXR-LBD 상호 작용의 결과로서 FRET 비율 견고하고 빠른 응답이 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다.
여기, 우리는 이러한 공 초점 현미경 분석 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)와 같은 FRET을 측정하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명하는 중요한 단계를 강조, 잠재적 인 문제를 해결하고 다른 방법에 대해 설명합니다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서를 이용하여, FXR-LBD와 담즙산 상호 작용은 정량 및 살아있는 세포에 직접 모니터링하고 실시간으로 담즙산 수송 및 역학을 가시화 신속하고 간단한 방법을 제공 할 수있다. CytoBAS NucleoBAS를 인코딩 및 포유류 발현 플라스미드는 시판되고있다. 따라서,이 바이오 센서는, 상기에 기여담즙산 수송 또는 FXR을 활성화하고 담즙산 생물학 및 시그널링에 대한 깊은 통찰력을 제공하는 화합물의 이해.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 살아있는 세포에서 담즙산 수송 시공간 역학을 모니터링 할 수있는 새로운 유전자 부호화 담즙산 센서의 사용을 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 바이오 센서함으로써 FRET 기반 담즙산 센서 (BAS)을 형성 FXR-LBD 융합되어 하늘색 및 황 형광 단백질로 구성되어있다.
세포 배양 및 FACS 또는 (공 초점) 현미경 기본적인 경험을 가지고 할 때 담즙 산성 센서는 사?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
Riferimenti
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