Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule
Summary
Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.
Abstract
Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che natural killer (NK), le cellule sono in grado di sradicare ortotopicamente impiantato GL26 topo e nel ratto CNS-1 gliomi maligni subito dopo attecchimento intracranica se le cellule tumorali sono resi carenti nella loro espressione della lectina galectina β-galactoside vincolante -1 (gal-1). Lavori più recenti mostra ora che una popolazione di + / CD11b + cellule mieloidi Gr-1 è fondamentale in tal senso. Per comprendere meglio i meccanismi con cui NK e le cellule mieloidi cooperano per conferire gal-1-deficienti rifiuto tumore abbiamo sviluppato un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico-gliomi infiltranti (PBMC). Il metodo è dimostrato qui confrontando PBMC infiltrazione nel microambiente tumorale di gal-1-esprimendo GL26 gliomi con quelli resi gal-1-carente via shRNA atterramento. Il protocollo inizia con una descrizione di come la cultura e la preparazione GL26 cells per inoculazione nella C57BL / 6J cervello singenico del mouse. E poi spiega i passi necessari per l'isolamento e l'analisi dei flussi di citometria-glioma infiltrarsi PBMC dei primi del microambiente tumorale al cervello. Il metodo è adattabile ad una serie di disegni in vivo sperimentali in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Il metodo è sensibile e altamente riproducibile, come PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati da tumori intracranici appena 24 ore attecchimento post-tumore con conta di cellule simili osservati dal punto abbinato tumori tempo durante esperimenti indipendenti. Un singolo sperimentatore può eseguire il metodo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Modelli alternativi di glioma e / o anticorpi di rilevamento specifici per cellulari possono essere utilizzati anche a discrezione degli sperimentatori 'per valutare l'infiltrazione di diversi altri immuntipi di cellule e di interesse, senza la necessità di modifica del procedimento generale.
Introduction
Gliomi sono una classe di tumori cerebrali neuroepiteliali derivanti da glia trasformato nel sistema nervoso centrale (CNS). Di tutti i gliomi, Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) di grado IV glioma, o glioblastoma (GBM), è la più comune e letale 1. GBM è altamente refrattario alla cura standard di corrente, che consiste nella resezione del tumore, per quanto possibile seguito da radioterapia più chemioterapia concomitante e adiuvante con temozolomide 2. Questi tumori mortali portare una prognosi infausta di soli 15-18 mesi di sopravvivenza dal momento della diagnosi iniziale con solo il 5% dei pazienti sopravvissuti alla malattia dopo 5 anni 3.
La presenza della barriera emato-encefalica (BBB), la mancanza di cellule presentanti l'antigene professionali (APC), e l'esistenza precedentemente non identificato di bona fide strutture linfatiche all'interno del cervello 4 hanno portato alla nozione di GBM immuni privilegiato. Tuttavia, numerosi studi ora show che questi tumori cerebrali infatti generano il reclutamento di cellule immunitarie periferiche che sono prevalentemente di origine mieloide che includono monociti, macrofagi e cellule mieloidi soppressore di derivazione (MDSCs) 5. GBM influenza anche l'attività di microglia cerebrale residente a diventare pro-oncogeno 6,7. Cellule linfoidi come le cellule T CD8 + 8 e CD56 delle cellule + natural killer 9 sono presenti anche all'interno del microambiente tumorale, ma in molte meno numeri, un dato di fatto pensa sia dovuto alla funzione immunosoppressiva istigato da fattori di glioma di derivazione sul tumore associato macrofagi ( TAM) 10. Cellule T CD4 + sono presenti anche nel GBM, ma gran parte di questa popolazione esprime anche CD25 e FoxP3, creatori di immunosoppressiva T regolatorie (T reg) celle 11. Lo stato immunosoppressivo complessivo di GBM culmina nella promozione di evasione immunologica e la progressione del tumore 12.
<p class= "jove_content"> Una migliore comprensione dei meccanismi di GBM immunosoppressione è fondamentale per lo sviluppo di efficaci strategie di immunoterapia progettati per stimolare il sistema immunitario contro il tumore. Negli ultimi 15 anni il nostro laboratorio ha lavorato per superare i meccanismi del cervello tumore immunosuppresson al fine di sviluppare efficaci nuovi immunotherapeutics anti-GBM 13-19. Il culmine di questo lavoro è ora portato ad uno studio clinico disegnato per valutare un citotossico combinato e terapeutico immuno-stimolante per i pazienti con nuova diagnosi di GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).Il nostro lavoro più recente indica che CNS-1 le cellule GBM del mouse GL26 e ratto bloccano anti-tumorale di cellule NK sorveglianza immunitaria producendo grandi quantità di β-galattoside-lectina legante galectina-1 (gal-1) 20. Questo è stato dimostrato di sopprimere l'espressione di gal-1 nelle cellule di glioma utilizzando shRNA mediata knockdown gene. In vitro speriments hanno dimostrato che le cellule di glioma gal-1-carente proliferavano normalmente nella cultura, ma hanno subito il rifiuto rapido subito dopo attecchimento intracranica in singenico C57BL / 6J o RAG1 – / – mice, stabilendo così l'indipendenza della T o B- celle su questa forma di rifiuto del tumore. Immunodeplezione cellule NK con l'anti-asialo GM 1 anti-siero o anticorpi monoclonali NK1.1 portato alla completa ristrutturazione di intracranica crescita glioma gal-1-carente, stabilendo il ruolo delle cellule NK in gal-1-carente rifiuto glioma. Mostriamo ora che immunodeplezione di cellule mieloidi Gr-1 + / CD11b + è sufficiente a prevenire gal-1-carente rifiuto glioma nonostante la presenza di cellule NK, rivelando così un ruolo ausiliario indispensabile per le cellule mieloidi in favoreggiamento di gal NK-mediata lisi tumorale -1-deficienti (dati non pubblicati). Questo risultato inatteso ci ha portato a sviluppare un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) cheinfiltrarsi nel microambiente tumorale al cervello poco dopo attecchimento intracranica in modo da poter meglio caratterizzare gli eventi infiltrazione immunitario quel predicato gal-1-carente rifiuto glioma.
Il metodo è dimostrata qui utilizzando cellule di glioma del mouse GL26 che la proteina fluorescente mCitrine costitutivamente espressa, chiamata GL26-Cit, che consentono la visualizzazione diretta delle cellule tumorali al microscopio a fluorescenza 21. Queste cellule sono stereotactically innestate nel cervello di singenici C57BL / 6J e sono autorizzati a crescere per 24, 48 o 72 ore prima del mouse eutanasia. PBMC-gliomi infiltranti vengono poi isolate e immunolabeled utilizzando anticorpi anti -CD45, -gr-1, -CD11b e -NK1.1 anticorpi di superficie cellulare unitamente immunomarcatura intracellulare per granzima B (GzmB). Questa combinazione specifica di anticorpi permette l'identificazione di Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi infiltranti il tumore e NK1.1 +, le cellule NK, tipi di cellule che abbiamo been implicato in gal-1-carente rifiuto tumore. Il profilo infiltrazione immunitario del gal-1-carente GL26-Cit glioma, denominato qui come GL26-Cit-gal1i, viene quindi paragonato a quello di gliomi che esprimono livelli normali di gal-1 denominato GL26-Cit-NT che contengono un non- il targeting di controllo shRNA tornante. Il protocollo inizia con una descrizione su come la cultura delle cellule GL26-Cit glioma in vitro, che è seguita da una spiegazione su come innestare ortotopicamente queste cellule nello striato di singenici C57BL / 6J. Si procede quindi a enumerare i passi necessari per l'isolamento e immunomarcatura di PBMC-gliomi infiltranti per l'analisi di citometria di flusso. Il protocollo si conclude con la spiegazione di analisi dei dati e standard di rappresentazione grafica.
La dimostrazione rivela che entrambi Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK1.1 + NK preferenzialmente accumulano all'interno del microambiente tumorale al cervello gal-1-carente entro 48hr di impianto del tumore, un risultato che aiuta a spiegare perché questi tumori rapidamente sottoposti a completa lisi tumorale circa 1 settimana post-tumore attecchimento 20. Il metodo è facilmente adattabile a diversi modelli sperimentali in vivo in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Un singolo sperimentatore può eseguire il protocollo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Il metodo può anche essere combinato con esperimenti volti a caratterizzare il profilo di PBMC circolante nei topi affetti da tumore in confronto con quelli che infiltrano il cervello in modo da identificare fenotipi immunosoppressione specificamente indotti dal microambiente tumorale. L'applicazione di questa e simili metodi dovrebbe facilitare una migliore comprensione dei fattori coinvolti nel traffico di cellule immunitarie periferiche nel microambiente tumorale al cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per l'isolamento e analisi citofluorimetrica delle PBMC che hanno infiltrato inizi del mouse tumore cerebrale microambiente. Sospensioni cellulari glioma sono generati ad una concentrazione specificato dal sperimentalista che sono stereotactically innestato nello striato del cervello di topo. I topi sono poi eutanasia in momenti predeterminati previsti dal disegno sperimentale e il loro cervello sono raccolta e trattata per isolare PBMC-glioma infiltrante …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 a MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 NS082311 e-NS084275 a PRL; sovvenzioni da Happy Hearts Leah, Università del Michigan Comprehensive Cancer Center assegnato a MGC e PRL; il Dipartimento di Neurochirurgia, Università del Michigan School of Medicine; l'Istituto del Michigan per clinica e ricerca di salute, sostenuto da NIH concedere 2UL1-TR000433; l'Università del Michigan Cancer Biology borsa di formazione sostenuto da NIH / NCI (National Cancer Institute) concessione T32-CA009676; l'Università del Michigan di formazione clinica e di base Neuroscienze sostenuto da NIH / NINDS concedere T32-NS007222; e l'Università del Michigan Medical Training Program Scientist sostenuto da NIH / NIGMS (Istituto Nazionale di Medicina Generale Scienze) concedere T32-GM007863. Gli autori unre grato per la leadership accademica e il sostegno ricevuto dalla dottoressa Karin Muraszko e il Dipartimento di Neurochirurgia; a M. Dahlgren, D. TomFord, e S. napoletano per eccellente supporto amministrativo; a M. Dzaman per l'eccellente assistenza tecnica; e di Phil F. Jenkins per il generoso sostegno per l'acquisto di un microscopio elettronico a scansione Zeiss 3D. Riconosciamo anche il laboratorio Kuchroo alla Harvard Medical School da cui è stata redatta una versione modificata della strategia mediatica-mediata centrifugazione densità per isolamento delle cellule mononucleari del cervello.
Materials
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
| 0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
| 1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
Riferimenti
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