İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi
Summary
Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.
Abstract
Laboratuvar son doğal katil (NK) hücreler, kanser hücrelerinin β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin salgılamasında eksiklik kılınmış halinde intrakranial engraftment sonra merkezi sinir sistemi 1 malign gliomalar yakında ortotopikal implante fare ve sıçanı GL26 yok etme kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamaktadır -1 (gal-1). Daha yeni iş artık Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bir popülasyonu bu yönde önemli olduğunu göstermektedir. Daha NK ve miyeloid hücrelerin, izolasyon ve glioma infiltre periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) analizi için geniş kapsamlı bir protokol geliştirilmiştir gal-1-eksikliği olan tümör reddinin kazandırmak için ortak olarak kullanmaktadırlar mekanizmalarının anlaşılması. Yöntem tümörün mikro içine PBMC sızmasını karşılaştırarak burada gösterilmiştir ShRNA demonte aracılığıyla gal-1 eksikliği hale olanlarla GL26 gliomalarda gal-1 ifade. Protokol bir bilgi ile başlar nasıl kültürü ve GL26 ce hazırlamaksingeneik C57BL / 6J fare beyin aşılama için lls. Daha sonra erken beyin tümörü mikroçevresinin gelen glioma-infiltre PBMC'lerin izolasyon ve akım sitometri analizi yer alan adımları açıklar. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo deney tasarımları bir dizi uyarlanabilir. Glioma süzücü PBMC'ler bağımsız deneyler boyunca zaman noktası eşleşen tümörlerden gözlenen benzer hücre sayısı ile 24 saat sonrası tümör melezleme olan en kısa sürede, kafatası tümörlerinden izole edilebilir bir yöntem, hassas ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat yöntemi gerçekleştirebilir. Alternatif glioma modeller ve / veya hücre spesifik saptama antikorları ayrıca birçok Immun süzülmesini değerlendirmek için deneysel çalışan takdirine kullanılabilirGenel prosedüre değişiklikler gerektirmeden ilgi e hücre tipleri.
Introduction
Gliomalar, merkezi sinir sistemi (CNS) dönüştürülmüş glia kaynaklanan nöroepitelyal Beyin kanserlerinin sınıfıdır. Tüm Gliomaların, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Evre IV glioma veya glioblastoma (GBM), en yaygın ve 1 ölümcül olanıdır. GBM temozolomidin 2 ile radyasyon artı eşzamanlı ve adjuvan kemoterapi takiben ölçüde mümkün tümör rezeksiyonu oluşan mevcut standart-bakım son derece dirençli olduğunu. Bu ölümcül kanserler 5 yıl sonra 3 hastalık hayatta kalan hastaların sadece% 5 ile ilk tanı anında hayatta kalma, sadece 15-18 ay kasvetli prognoz taşır.
Kan-beyin bariyeri (BBB) varlığı, profesyonel antijen sunan hücreler eksikliği (APC'ler) ve beyin 4 içindeki niyetli lenf yapılarının daha önce tanımlanmamış varlığı ayrıcalıklı immün GBM kavramına yol açmıştır. Ancak, çok sayıda çalışmalar artık shobu beyin kanserleri gerçekten de, monositler, makrofajlar, ve miyeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSCs) 5 içerir kökenli ağırlıklı miyeloid periferal bağışıklık hücrelerinin alınmasını doğurmak bu w. GBM de 6,7 yanlısı tümörijenik olmak için beyin ikamet mikroglia aktivitesini etkilemektedir. Örneğin CD8 + T hücrelerinin CD56 + 8 ve doğal öldürücü hücrelerin 9 lenfatik hücreler de tümörün mikro-ortamı içinde mevcut olan, ancak çok daha az sayıda, düşünülen bir gerçektir (nedeniyle tümör bağlantılı makrofajlar üzerinde glioma türetilmiş faktör tarafından teşvik bağışıklık işlevine olduğu TAM) 10. CD4 + T hücreleri GBM de mevcut, ancak bu nüfusun çok da CD25 ve Foxp3, immünosupresif T regülatör (T reg) hücrelerinin 11 yapımcıları ifade eder. GBM genel bağışıklık durumu immünolojik kaçış ve tümör ilerlemesi 12. promosyon sona eriyor.
<p class= "jove_content"> GBM immunsupresyonun mekanizmaların daha iyi anlaşılması tümöre karşı bağışıklık sistemini uyarmak için tasarlanmış etkili immunoterapötik stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Son 15 yılda bizim laboratuvar etkili yeni bir anti-GBM immünoterapötiklerin 13-19 geliştirmek için beyin tümörü immunosuppresson mekanizmalarını aşmak için çalıştı. Bu eserin doruk noktası artık yeni teşhis GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) olan hastalar için kombine sitotoksik ve bağışıklık uyarıcı terapötik değerlendirmek için tasarlanmış bir klinik çalışmaya yol açmıştır.En son çalışmalar, fare ve sıçan CNS GL26-1 GBM hücreleri β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin-1 (gal-1), 20, büyük miktarlarda üretilmesi anti-tümör NK hücre immün gözetim bloke olduğunu göstermektedir. Bu shRNA aracılı gen demonte kullanılarak glioma hücreleri gal-1 ekspresyonunu bastırmak ile gösterilmiştir. İn vitro experiments gal-1 eksikliği glioma hücreleri kültürde normal çoğaldı gösterdi, ancak genetik olarak özdeş C57BL / 6J veya RAG1 içine intrakranial engraftment kısa bir süre sonra hızlı ret uygulandı – / – farelerin, böylece bu formda T veya B hücrelerinin bağımsızlığını kuran tümör rejeksiyon. Anti asiolo GM 1, anti-serum veya gal-1-eksikliği olan glioma reddi NK hücrelerinin rolünün oluşturulması intrakraniyal gal-1-eksikliği olan glioma büyümesinin komple restorasyonuna yol açan monoklonal NK1.1 antikorları ile NK hücre bağışıklık sistemine. Şimdi Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bu bağışıklık sistemindeki durumu göstermektedir, böylece, NK-aracılı gal yardımında miyeloid hücreleri için bir vazgeçilmez yardımcı bir rol ortaya NK hücrelerin varlığına rağmen gal-1-eksikliği olan gliom reddini önlemek için yeterli olan -1 eksik tümör lizis (yayınlanmamış veriler). Bu beklenmedik sonuç, periferik kan mononükleer hücrelerin izolasyonu ve analiz (PBMC) için kapsamlı bir protokol geliştirmek için yol olduğudaha iyi gal-1 eksik glioma reddini yüklem bağışıklık sızma olayları karakterize böylece yakında intrakranial engraftment sonra beyin tümörü mikro sızmak.
Yöntem, GL26-Cit olarak adlandırılan bir şekilde eksprese mCitrine floresan protein, floresan mikroskobu 21 doğrudan tümör hücresi görüntülenmesine izin vereceği şekilde bir fare GL26 glioma hücreleri kullanılarak burada gösterilmiştir. Bu hücreler stereotaksi singeneik C57BL / 6J fareler, beyin içine aşılanan ve önceki fare ötenaziye 24, 48 ya da 72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır. Glioma nüfuz eden PBMC'ler daha sonra anti -CD45 kullanılarak izole edilir ve imüno-edilir, -Gr-1, -CD11b ve granzim B hücre içi immunolabeling birlikte -NK1.1 hücre yüzeyi antikorlar (GzmB). Antikorların Bu özel bileşimi Bu var b tümör-süzücü Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin tanımlanması ve NK1.1 +, NK hücreleri, hücre tipleri için izin verireen gal-1 eksikliği tümör reddi karışmış. Gal-1-eksikliği olan GL26-Cit glioma bağışıklık infiltrasyonu profili, GL26-Cit-gal1i olarak anılacaktır, daha sonra, bir non-içeren gal-1 GL26-Cit-NT adı normal seviyelerini sentezleyen gliomlar ile karşılaştırılır Kontrol ShRNA hairpin hedefleme. Protokol ortotopikal singeneik C57BL / 6J fareler striatumu içine, bu hücrelerin sokmak için nasıl bir açıklama takip eder, in vitro olarak nasıl Kültür GL26-Cit glioma hücreleri üzerinde bir açıklama ile başlar. Daha sonra izolasyon ve akım sitometri analizi için glioma-infiltre PBMC'lerin immunolabeling ilgili adımları saymaya devam eder. Protokol standart veri analizi ve grafik gösterimi bir açıklama ile sona eriyor.
Gösteri ortaya koymaktadır hem Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri tercihen 48 içinde gal-1 eksikliği beyin tümörü mikroçevresinin içinde birikirTümör implantasyonu, bu tümörler hızla tam tümör lizis yaklaşık 1 hafta sonrası tümör melezleme 20 geçmesi açıklamaya yardımcı olan bir sonucun hr. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo olarak farklı deney tasarımları bir dizi için de uyarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat protokolü gerçekleştirebilir. Yöntem aynı zamanda, özellikle tümör mikro-ortamı tarafından uyarılan bağışıklık bastırma fenotipleri tespit etmek, böylece beyin sızmaya olanlar ile karşılaştırıldığında tümör taşıyan farelerdeki PBMC'ler dolaşan profilini karakterize etmek için amaçlanmıştır deneyler ile kombine edilebilir. Bu ve benzeri yöntemlerin uygulanması beyin tümörü mikroçevresinin içine periferik bağışıklık hücrelerinin kaçakçılığıyla faktörlerin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, erken fare beyin tümör mikro sızmış PBMC izole edilmesi ve akış sitometrik analiz için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Glioma hücre süspansiyonları stereotaksi fare beyninin striatumu içine aşılanan deneye ile belirtilen bir konsantrasyonda oluşturulur. Fareler daha sonra deney tasarımı ile belirtilmiş önceden belirlenmiş zaman noktalarında itlaf edilmiş ve beyinleri hasat edildi ve florokrom-eşlenik birincil antikor kombinasyonları ile immunolabeled edilir glioma …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) MGC R01-NS074387, R01-R21-NS057711 ve NS091555 hibe ve / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; NIH / NINDS PRL için R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 ve NS084275 verir; Leah Mutlu Kalpler gelen hibeler, MGC ve PRL layık Michigan Kapsamlı Kanser Merkezi'nde Üniversitesi; Nöroşirürji Tıp Michigan Okulu Üniversitesi Anabilim Dalı; NIH hibe 2UL1-TR000433 tarafından desteklenen Klinik Michigan Enstitüsü ve Sağlık Araştırması; NIH / NCI (National Cancer Institute) hibe T32-CA009676 tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi Kanser Biyolojisi Eğitim Hibe; NIH / NINDS tarafından desteklenen Klinik ve Temel Nörobilim Michigan Eğitim Üniversite T32-NS007222 hibe; ve NIH / NIGMS (Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü) tarafından desteklenen Michigan Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı Üniversite T32-GM007863 hibe. YazarlarDr Karin Muraszko ve Nöroşirürji Anabilim alınan akademik liderlik ve destek için müteşekkir yeniden; M. Dahlgren, D. Tomford ve mükemmel idari destek S. Napolitan için; üstün teknik yardım için, M. Dzaman için; ve bir Zeiss 3D Taramalı Elektron Mikroskobu satın alma yönünde cömert destek için Phil F. Jenkins için. Biz de beyin mononükleer hücrelerin izolasyonu için yoğunluk santrifüj medya aracılı stratejinin değiştirilmiş bir versiyonu çizilmiş olan Harvard Tıp Okulu'nda Kuchroo laboratuvar kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
| 0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
| 1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
Riferimenti
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., & Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R. et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T. et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16 Suppl 4, iv1-63 (2014).
- Louveau, A. et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. 523, 337-341 Nature. (2015).
- Kennedy, B. C. et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., & Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., & Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Kmiecik, J. et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., & Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S. et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., & Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., & Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F. et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F. et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y. et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D. et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F. et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S. et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A. et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J. et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J. et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., & Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. (2008).
- Stirling, D. P., & Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T. et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., & Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M. et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C. et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J. et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A. et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L. et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T. et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M. et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
