Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
الخلايا المزروعة داخل CPF ترى أي تغييرات في الأكسجين أو ثاني أكسيد الكربون تركيزات لأنها تتحرك من الحاضنة لتجهيز غرفة إلى غرفة المجهر والظهر. ومن الأهمية بمكان أن الظروف في كل غرفة تتم مطابقة إلى الحاضنة الخاصة التي يتم الاحتفاظ الخلايا قبل أن يتم إزالة الخلايا من الحاضنة. الجو داخل الجهاز بشكل مستمر HEPA تصفية وتخصيص فيما يتعلق تركيزات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون. يمكن زراعتها الخلايا بتركيزات موحدة لشركات الأمن الخاصة أو NSCs، 5٪ و 9٪ على التوالي. أو تركيزات بديلة يمكن اختيار لأنواع مختلفة من الخلايا أو لتجارب محددة. وبالتالي، يتم تزويد الجهاز مع مصادر ثابتة من الأكسجين الصف الطبية، وثاني أكسيد الكربون، والنيتروجين (الشكل 4). يتم تزويد كل ثلاثة من هذه الغازات من خلال أنظمة متعددة الغاز محدد ضمان امدادات ثابتة. ويتم تزويد الجهاز أيضا مع خليط الغاز المعايرة تتكون من10٪ (± 0.01٪) غاز ثاني أكسيد الكربون في الأكسجين. ويضم أنظمة متعددة خارج منشأة لانتاج الخلية ويتم إيصالها الغازات في منشأة من خلال السقف. وتقع الغاز المعايرة داخل المنشأة. يتم تزويد الجهاز بالإضافة إلى ذلك مع فراغ المنزل، وأيضا من خلال السقف. باستخدام نظام المراقبة الإلكترونية واللاسلكية وحدة الإرسال، يتم مراقبة باستمرار الضغوط إخراج جميع الفتحات. في حال أن يقع أي ضغط خارج النطاق، واتصل هاتفيا مشغلي منشأة لانتاج الخلايا تلقائيا وأخطرت هذه أن التدابير الملائمة يمكن أن تؤخذ.
تلبية متطلبات الطاقة للجهاز لمدة ستة مخصصة 120 V الدوائر تنازلي من السقف وتوصيل مولدات احتياطية في المستشفى لضمان امدادات ثابتة. يتم التحكم في تشغيل الجهاز عن طريق برنامج على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام الكمبيوتر بالطاقة من خلال توفير إمدادات الطاقة غير المنقطعة. هذه الترتيبات الكهرباء والكمبيوترتأكد من أن وظائف النظام بشكل مستمر حتى في حالة حدوث فشل نظام السلطة العامة. برنامج السيطرة على جهاز يحتوي على واجهة رسومية سهلة الاستخدام (الشكل 1)، التي تتيح للتحكم في تركيز الأكسجين وثاني أكسيد الكربون وكذلك الضغوط درجة الحرارة، والرطوبة، والغرفة. وسجلت قيم كل هذه المعايير بشكل مستمر لتوفير سجل تشغيل جميع المعلمات الجهاز. ويدعم هذه البيانات حتى على خادم بعيد كل ليلة لحماية سلامتها. يمكن الوصول إلى جهاز الكمبيوتر والبرامج عن بعد من قبل المستخدمين الإدارية لتقييم و / أو تغيير أي معلمة. بالإضافة إلى ذلك، الكمبيوتر والبرمجيات ويمكن الوصول عن بعد، مما يتيح تقييم تفاعلية من المعلمات أجهزة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها مع المستخدمين المحليين. يتم توصيل وحدة وإرسال إنذار إضافية للجهاز بحيث يتم إخطار مشغلي منشأة لانتاج الخلية من أي حالة خارج نطاق الجهاز. الوصول عن بعد جapabilities سماح تسجيل الدخول وتقييم خصوصيات حالة خارج النطاق.
تم تصميم الجهاز كنظام وحدات في كل من ماكرو والشعور الجزئي. وحدات زراعة الخلايا الفردية، مثل الحاضنات وغرف المعالجة، يمكن تخصيص فيما يتعلق أبعاد ومتطلباتها وكذلك في التخطيط مع الاحترام لبعضهما البعض. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم وظائف السيطرة على وحدات فردية هي في حد ذاتها وحدات مثل التي تحكم الغاز في الغلاف الجوي الفردية، على سبيل المثال، يمكن الاستعاضة عنها بسهولة دون اضطراب كبير في النظام.
غرف المعالجة المتخصصة، مثل واحد لرؤية المجهري والتلاعب في مزارع الخلايا، يتم تكييفها بسهولة إلى النظام. كلا على النقيض من المرحلة ومضان المجهر هي داخل النظام (الشكل 6) بحيث الخلايا يمكن أن تكون ملطخة على الهواء مباشرة، والمستعمرات يمكن تشريح في الظروف الجوية نفسها كما في الداخل رانه الحاضنات. التوجيه من الكابلات من خلال الحلقات أغلقت في الجدران الجانبية من غرفة معالجة يسمح المعدات مثل امدادات الكهرباء وأجهزة الكمبيوتر أن تبقى خارج الجهاز، وعادة على عربة (الشكل 6).
غرف المعالجة في منشأة لانتاج الخلايا لديها نمط تدفق الهواء مختلفة من BSCs التقليدية. في BSCs التقليدية، يتدفق تدفق الهواء إلى أسفل من فتحة العادم المركزي وانشقاقات في مسارين منفصلين، والتي يتم تناولها من قبل اثنين من فتحات كمية مختلفة في الجزء الأمام والخلف من الطابق مجلس الوزراء. على النقيض من ذلك، فإن CPF ديه تنفيس واحدة في الجزء الأمامي من السقف. تدفق الهواء إلى الأسفل ونحو الجزء الخلفي من الغرفة، حيث ثم فإنه يتم رسمها صعودا إلى تنفيس المدخول. على الرغم من أن هذه الشراكة هي بطبيعتها نظيفة جدا، وهذا نمط تدفق الهواء فريد من نوعه يعني أن الفنيين لديها لضبط قليلا تقنيتهم للحد من مخاطر التلوث. كما هو الحال مع ش.م.ب التقليدية، مختبر عامل الصورةhould معها تجنب وضع أيديهم المنبع لوحات ثقافة الخلية المفتوحة وزجاجات وسائل الإعلام. ومع ذلك، تم تغيير الاتجاه الذي هو المنبع في CPF
مرفق إنتاج خلايا المختبر نفسه هو المعيار إلى حد ما، وتأتي مجهزة الثلاجة -20 درجة مئوية، والمجمد -80 درجة مئوية، 4 ° C ثلاجة، جهاز للطرد المركزي، وحمام الماء. ويضم المختبر أيضا بالوعة مع الضوابط القدم للتشغيل حر اليدين مريحة. من أجل هذا المختبر لتصبح السريري منشأة لانتاج خلايا وظيفية، ومع ذلك، لا يزال يتعين إجراء عدة تعديلات إضافية. أولا، الجهاز نفسه يجب أن تتم ترقية لديك القدرة على رصد المركبات العضوية المتطايرة، والجسيمات، وتركيزات ثاني أكسيد الكلور الذي يستخدم لإزالة التلوث. ثانيا، وغرفة معالجة تحتوي على آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية قد يكون مقر وتوصيلها إلى بقية الجهاز عن طريق وحدة العازلة. وهذا سوف يسمح لفرز الخلايا وتنقية آرالسكان الخلية ansplantable تحت الظروف البيئية المناسبة. وأخيرا، يجب أن يضم الجهاز بأكمله داخل غرفة نظيفة الجدار لينة. وهذا يوفر المنظمة الدولية للتوحيد القياسي فئة (ISO) 8 البيئة للجهاز 5.
عقم عالية وطبيعة الكمبيوتر التي تسيطر عليها من CPF يجعل من نظام مثالي للتطبيقات المستقبلية مع العلاج القائم على الخلايا والعمليات التصنيعية الجيدة. والتخفيف من مخاطر التلوث إلى حد كبير، ولكن الأهم من ذلك أن شروط توسيع الخلية يتم تسجيلها تلقائيا، وتحفظ من قبل نظام الكمبيوتر. موثقة الانحرافات في تركيزات غازات، ودرجة الحرارة، والرطوبة، وجميع الأحداث من الوصول إلى نظام صارم. هذا يمكن أن يساعد كثيرا عند التحقيق في مشاكل جودة المنتج. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود. استخدام أي وجميع الكواشف واللوازم (على سبيل المثال، مكونات وسائل الإعلام، الماصات، لوحات) يجب أن تكون موثقة بشكل منفصل. إضافةitionally، هناك العديد من المشاكل المحتملة (بما في ذلك العديد من أشكال الخطأ البشري) التي يمكن أن تنشأ والتي لا علاقة لها تماما لمتغيرات موثقة من قبل نظام مراقبة هذه الشراكة ل. وهكذا، فإن الحاجة إلى الموظفين المدربين تدريبا عاليا وثائق اليدوية مفصلة من المهام لا يزال في مكانه.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أن نعترف الموظفين في Biospherix لمساعدتهم في تعلم استخدام نظام زراعة الخلايا Xvivo المغلقة، خصوصا مات فريمان. موظفي الشركة مايلز آند كيلي البناء، وشركة لعملهم في إنشاء البنية الأساسية للمختبرات، وخاصة روس هيوز. موظفو مستشفى الأطفال في دائرة مقاطعة أورانج من المرافق والخدمات المساندة لعملهم في تنسيق إعادة تشكيلها مختبر، خصوصا آدم Lukhard وديفين Hugie. موظفو مستشفى الأطفال في دائرة مقاطعة أورانج نظم المعلومات لمساعدتهم في إنشاء البنية التحتية لإدارة البيانات والوصول عن بعد، وخاصة تران نام؛ مستشفى الأطفال في مقاطعة أورانج فريق الإدارة التنفيذية للحصول على دعم طويل الأمد على المشروع، وخاصة الدكتورة ماريا Minon وبرنت Dethlefs. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مستشفى الأطفال في مقاطعة أورانج، ومعهد كاليفورنيا للالتجدد الطبه من خلال TR3-05476 منحة لخدمات الصحة العمومية. وساهمت جميع المؤلفين بالتساوي على هذا العمل.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |