बेसिक और preclinical अनुसंधान के लिए एक संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली में मानव pluripotent और तंत्रिका स्टेम सेल संवर्धन
Summary
Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
Abstract
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Introduction
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Protocol
Representative Results
Discussion
सीपीएफ के भीतर विकसित कोशिकाओं में ऑक्सीजन या कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता में कोई बदलाव नहीं देखने के रूप में वे चैम्बर प्रसंस्करण चैम्बर माइक्रोस्कोप और वापस करने के लिए इनक्यूबेटर से चलते हैं। यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक कक्ष में स्थिति विशेष इनक्यूबेटर में जो कोशिकाओं कोशिकाओं इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं इससे पहले रखा जाता है करने के लिए मिलान कर रहे हैं। तंत्र के भीतर माहौल लगातार HEPA फ़िल्टर है और ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता के संबंध में प्रचलित है। प्रकोष्ठों पीएससी या एनएससी, 5% और 9%, क्रमशः के लिए मानक मात्रा में उगाया जा सकता है; या वैकल्पिक सांद्रता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए या विशिष्ट प्रयोगों के लिए चुना जा सकता है। इस प्रकार, तंत्र चिकित्सा ग्रेड ऑक्सीजन, कार्बन डाइऑक्साइड और नाइट्रोजन (चित्रा 4) के लगातार स्रोतों के साथ आपूर्ति की है। इन गैसों के सभी तीन गैस विशिष्ट कई गुना प्रणाली है कि निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित द्वारा आपूर्ति की जाती है। तंत्र भी एक अंशांकन गैस मिश्रण से मिलकर साथ आपूर्ति की है10% (± 0.01%) ऑक्सीजन में कार्बन डाइऑक्साइड। कई गुना सिस्टम सेल उत्पादन सुविधा के बाहर रखे जाते हैं और गैसों छत के माध्यम से सुविधा में पहुंचाया जाता है। अंशांकन गैस सुविधा के भीतर रखे है। तंत्र इसके अतिरिक्त, घर वैक्यूम के साथ आपूर्ति की है भी छत के माध्यम से। एक इलेक्ट्रॉनिक निगरानी प्रणाली का उपयोग करते हुए और वायरलेस इकाइयों को भेजने, सभी manifolds के उत्पादन के दबाव लगातार निगरानी कर रहे हैं। घटना है कि किसी भी दबाव रेंज से बाहर जाता है, सेल उत्पादन सुविधा ऑपरेटरों स्वचालित रूप से फोन किया और इस तरह के अधिसूचित किया है कि उचित कार्रवाई की जा सकता है।
तंत्र की बिजली की आवश्यकताओं को छह समर्पित 120 वी सर्किट छत से उतरते से मुलाकात की और एक निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए अस्पताल के बैक-अप जनरेटर से जुड़े हैं। तंत्र के आपरेशन सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है एक uninterruptible बिजली की आपूर्ति के माध्यम से संचालित एक पीसी आधारित कंप्यूटर पर। इन बिजली और कंप्यूटर की व्यवस्थायह सुनिश्चित करें कि कार्य प्रणाली लगातार यहां तक कि एक सार्वजनिक बिजली व्यवस्था की विफलता की स्थिति में। सॉफ्टवेयर तंत्र को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल इंटरफ़ेस (चित्रा 1) जो ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता के नियंत्रण के साथ ही तापमान, आर्द्रता, और चैम्बर दबाव के लिए अनुमति देता है। इन सभी मापदंडों के मूल्यों में लगातार सभी तंत्र मापदंडों के चल रहे एक रिकॉर्ड उपलब्ध कराने के लिए दर्ज हैं। इस डेटा उनकी अखंडता की रक्षा के लिए हर रात एक रिमोट सर्वर पर समर्थित है। कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर का आकलन और / या किसी भी पैरामीटर को बदलने के लिए प्रशासनिक उपयोगकर्ताओं द्वारा दूर से पहुँचा जा सकता है। साथ ही, कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर दूर तक पहुँचा जा सकता है, तंत्र मापदंडों के इंटरैक्टिव आकलन की अनुमति और स्थानीय उपयोगकर्ताओं के साथ समस्या निवारण। एक अतिरिक्त अलार्म इकाई भेजने के तंत्र से जुड़ा है कि इस तरह के सेल उत्पादन सुविधा ऑपरेटरों तंत्र के किसी भी आउट-ऑफ-सीमा की स्थिति की सूचना दी जाती है। दूरदराज के उपयोग की गapabilities में लॉग इन करें और आउट-ऑफ-सीमा हालत की बारीकियों के आकलन के लिए अनुमति देते हैं।
तंत्र एक मॉड्यूलर प्रणाली के रूप में दोनों एक स्थूल और सूक्ष्म एक अर्थ में बनाया गया है। ऐसे इन्क्यूबेटरों और प्रसंस्करण के कक्षों के रूप में अलग-अलग सेल संस्कृति मॉड्यूल, एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ उनके आयामों और आवश्यकताओं के संबंध में के रूप में अच्छी तरह से अपने लेआउट में अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत मॉड्यूल के नियंत्रण कार्यों का सबसे खुद को मॉड्यूलर कि इस तरह के व्यक्तिगत वायुमंडलीय गैस नियंत्रकों, उदाहरण के लिए, आसानी से व्यवस्था करने के लिए महत्वपूर्ण विघटन के बिना बदला जा सकता है।
इस तरह के सूक्ष्म दृश्य और सेल संस्कृतियों के हेरफेर के लिए एक के रूप में विशेष प्रसंस्करण कक्षों, आसानी से व्यवस्था करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। दोनों चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली (चित्रा 6) इतना है कि कोशिकाओं को लाइव कलंकित किया जा सकता अंदर हैं, और कालोनियों टी अंदर के रूप में एक ही वातावरण की स्थिति में विच्छेदित किया जा सकतावह इन्क्यूबेटरों। प्रसंस्करण के चैम्बर की ओर दीवारों में बंद grommets के माध्यम से केबल की रूटिंग उपकरण जैसे बिजली की आपूर्ति और कंप्यूटर तंत्र के बाहर रखा जाना है, आमतौर पर एक गाड़ी (चित्रा 6) पर अनुमति देता है।
सेल उत्पादन सुविधा में प्रसंस्करण कक्षों पारंपरिक BSCs तुलना में एक अलग airflow के पैटर्न है। पारंपरिक BSCs में, airflow के एक केंद्रीय निकास वेंट से नीचे बहती है और दो अलग-अलग धाराओं, जो है तो आगे और पीछे कैबिनेट की मंजिल के हिस्से में दो अलग अलग सेवन vents के द्वारा लिया जाता है में विभाजन। इसके विपरीत, सीपीएफ छत के आगे के हिस्से में एक भी वेंट है। एयर नीचे की ओर और कक्ष, जहां यह तो एक सेवन वेंट में ऊपर की तरफ खींचा है के पीछे की ओर बहती है। हालांकि सीपीएफ स्वाभाविक बहुत साफ है, इस अद्वितीय airflow के पैटर्न का मतलब तकनीशियनों थोड़ा संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए उनकी तकनीक को समायोजित करने के लिए किया है। एक पारंपरिक बीएससी, एक प्रयोगशाला कार्यकर्ता एस के साथ के रूप मेंHould से बचने के लिए खुला सेल संस्कृति प्लेटों और मीडिया की बोतलों के अपस्ट्रीम उनके हाथ रखकर। हालांकि, जिस दिशा नदी के ऊपर है सीपीएफ में बदल दिया गया है
सेल उत्पादन सुविधा प्रयोगशाला में ही काफी मानक है और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सुसज्जित आता है, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज, एक सेंट्रीफ्यूज, और एक पानी के स्नान। प्रयोगशाला भी सुविधाजनक हाथों से मुक्त आपरेशन के लिए पैर नियंत्रण के साथ एक सिंक है। इस प्रयोगशाला के लिए आदेश में एक कार्यात्मक नैदानिक सेल उत्पादन सुविधा बनने के लिए, हालांकि, कई अतिरिक्त संशोधनों अभी भी किया जाना चाहिए। सबसे पहले, तंत्र खुद वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों, विविक्त, और क्लोरीन डाइऑक्साइड जो परिशोधन के लिए प्रयोग किया जाता है की सांद्रता की निगरानी करने की क्षमता है करने के लिए उन्नत किया जाना चाहिए। दूसरे, एक प्रसंस्करण के लिए एक FACS मशीन युक्त चैम्बर रखे और एक बफर मॉड्यूल के माध्यम से तंत्र के बाकी हिस्सों से जुड़ा जा सकता है। यह सेल छँटाई और टीआर की शुद्धि के लिए अनुमति देगाउचित पर्यावरणीय परिस्थितियों में ansplantable सेल आबादी। अन्त में, पूरे तंत्र एक नरम दीवार साफ कमरे के भीतर रखे जाना चाहिए। इस तंत्र 5 के लिए मानकीकरण (आईएसओ) कक्षा 8 पर्यावरण के लिए एक अंतरराष्ट्रीय संगठन है।
उच्च बाँझपन और सीपीएफ के कंप्यूटर नियंत्रित प्रकृति यह सेल आधारित चिकित्सा और अच्छा विनिर्माण प्रक्रियाओं के साथ भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए एक आदर्श व्यवस्था बना देता है। संक्रमण के जोखिम को बहुत कम किया जाता है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, सेल विस्तार की शर्तों स्वचालित रूप से दर्ज की गई और कंप्यूटर सिस्टम द्वारा संग्रहीत हैं। गैस की सांद्रता, तापमान, आर्द्रता, और सिस्टम में पहुँच की सभी घटनाओं में विचलन कड़ाई से दस्तावेज हैं। यह बहुत मदद कर सकते हैं जब उत्पाद की गुणवत्ता की समस्याओं की जांच। हालांकि, अब भी सीमाएं हैं। किसी भी और सभी अभिकर्मकों और आपूर्ति के उपयोग (जैसे, मीडिया घटकों, pipettes, प्लेट) को अलग से प्रलेखित किया जाना चाहिए। जोड़नाitionally, वहाँ (मानव त्रुटि के कई रूपों सहित) संभावित समस्या है कि पैदा कर सकते हैं जो पूरी तरह से चर सीपीएफ की निगरानी प्रणाली द्वारा दस्तावेज से संबंधित नहीं है की एक भीड़ हैं। इस प्रकार, उच्च प्रशिक्षित कर्मियों और कार्यों का विस्तृत मार्गदर्शन प्रलेखन के लिए जरूरत जगह में रहता है।
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Xvivo संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली, विशेष रूप से मैट फ्रीमैन का उपयोग करने के लिए सीखने में उनकी मदद के लिए Biospherix में कर्मचारियों स्वीकार करना चाहते हैं; मीलों और केली कंस्ट्रक्शन कंपनी, प्रयोगशाला के बुनियादी ढांचे, विशेष रूप से Russ ह्यूजेस की स्थापना में उनके काम के लिए इंक के कर्मचारियों; प्रयोगशाला फिर से तैयार करना, विशेष रूप से एडम Lukhard और डेविन Hugie समन्वय में सुविधाएं और समर्थन सेवा से अपने काम के लिए की ऑरेंज काउंटी विभाग के बच्चों के अस्पताल के कर्मचारियों; डेटा प्रबंधन के बुनियादी ढांचे और दूरदराज के उपयोग, विशेष रूप से वियतनाम ट्रॅन को स्थापित करने में उनकी मदद के लिए सूचना प्रणाली का ऑरेंज काउंटी विभाग के बच्चों के अस्पताल के कर्मचारियों; परियोजना है, विशेष रूप से डॉ मारिया Minon और ब्रेंट Dethlefs के अपने लम्बे समय से समर्थन के लिए ऑरेंज काउंटी के कार्यकारी प्रबंधन दल के बच्चों के अस्पताल। इस काम ऑरेंज काउंटी के बच्चों के अस्पताल और पुनर्योजी Medicin के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा वित्त पोषित किया गयाPHS को अनुदान TR3-05476 के माध्यम से ई। सभी लेखकों को इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया।
Materials
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Consumable Supplies | |||
| 2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
Riferimenti
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