Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
As células cultivadas dentro das CPF não vejo mudanças nas concentrações de oxigênio ou dióxido de carbono que se deslocam de incubadora para o processamento de câmara para microscópio de câmara e volta. É crítico que as condições em cada uma das câmaras são combinadas para a incubadora particular em que as células são mantidas antes que as células são removidas da incubadora. A atmosfera dentro do aparelho é continuamente HEPA-filtrado e é personalizável no que diz respeito às concentrações de oxigênio e dióxido de carbono. As células podem ser cultivadas em concentrações normais para unidades ou NSC, 5% e 9%, respectivamente; ou concentrações alternativos podem ser escolhidos para diferentes tipos de células ou para experiências específicas. Assim, o aparelho é fornecido com fontes de oxigénio constante de grau médico, dióxido de carbono e azoto (Figura 4). Todos os três destes gases são fornecidos por sistemas de colector de gás específico do que assegurar o abastecimento constante. O aparelho é também fornecido com uma mistura de gás de calibração consiste em10% (± 0,01%) de dióxido de carbono em oxigénio. Os sistemas de manifold estão alojados fora da unidade de produção de células e os gases são canalizados para a instalação através do teto. O gás de calibração está alojado no interior da instalação. O aparelho é fornecido adicionalmente com aspirador de casa, também através do teto. Usando um sistema de monitoramento eletrônico e sem fio unidades envio, as pressões de todos os colectores de saída são constantemente monitorados. No caso em que qualquer pressão cai fora do intervalo, os operadores das instalações de produção de células são automaticamente telefonou e notificada de tal forma que medidas apropriadas possam ser tomadas.
Os requisitos de energia do aparelho são atendidas por seis dedicados 120 V circuitos que descem do teto e ligados a geradores de back-up do hospital para garantir um fornecimento constante. O funcionamento do aparelho é controlado via software em um computador baseado em PC alimentado através de uma fonte de alimentação ininterrupta. Estes arranjos de poder e de computadorassegurar que o sistema funciona continuamente, mesmo em caso de falha do sistema do poder público. O software que controla o aparelho tem uma interface gráfica amigável (Figura 1) que permite o controlo das concentrações de oxigênio e dióxido de carbono, bem como pressões de temperatura, umidade, e de câmara. Os valores de todos estes parâmetros são registadas continuamente para fornecer um registro de execução de todos os parâmetros do aparelho. Este dados são copiados para um servidor remoto a cada noite para proteger a sua integridade. O computador eo software pode ser acessado remotamente por usuários administrativos para avaliar e / ou alterar qualquer parâmetro. Além disso, o computador eo software pode ser acessado remotamente, permitindo avaliação interativa de parâmetros de aparelhos e solução de problemas com os usuários locais. Uma unidade de envio de alarme adicional é ligado ao aparelho de tal modo que os operadores das instalações de produção de células são notificados de qualquer condição fora-de-gama do aparelho. O acesso remoto capabilities permitir o login e avaliação das especificidades da condição fora-de-gama.
O aparelho é concebido como um sistema modular tanto em uma macro e micro um sentido. módulos de cultura de células individuais, tais como incubadoras e câmaras de processamento, podem ser personalizadas no que diz respeito às suas dimensões e os requisitos, bem como na sua disposição com respeito um ao outro. Além disso, a maior parte das funções de controlo dos módulos individuais são eles próprios modular de tal modo que os controladores de gás atmosféricos, por exemplo, pode ser facilmente substituído sem perturbação significativa para o sistema.
câmaras de processamento especializado, tal como um para visualização microscópica e manipulação de culturas de células, podem ser facilmente adaptado ao sistema. Ambos de contraste de fase e microscópio de fluorescência estão dentro do sistema (Figura 6), de modo que as células podem ser coradas vivo, e as colónias podem ser dissecados nas mesmas condições atmosféricas dentro como tele incubadoras. Encaminhamento de cabos por meio de ilhós seladas nas paredes laterais da câmara de processamento permite que o equipamento, tal como fontes de alimentação e computadores para ser mantido no exterior do aparelho, geralmente sobre um carrinho (Figura 6).
As câmaras de processamento na unidade de produção de células têm um padrão de fluxo de ar diferente do BSC convencionais. Em BSCs convencionais, o fluxo de ar flui para baixo a partir de um orifício de evacuação central e se divide em duas correntes separadas, que são então levados até por duas aberturas de entrada diferentes na parte da frente e para trás do piso do armário. Em contraste, a PCF tem uma única abertura na parte da frente do tecto. O ar flui para baixo e em direcção à parte de trás da câmara, onde é, em seguida, conduzido para cima, para uma entrada de ventilação. Embora o CPF é inerentemente muito limpos, este padrão de fluxo de ar única significa que os técnicos têm de ajustar ligeiramente a sua técnica para reduzir o risco de contaminação. Tal como acontece com um BSC convencional, um trabalhador s laboratórioevitar hould colocando suas mãos a montante de placas de cultura de células abertas e garrafas de mídia. No entanto, o sentido a montante é que tenha sido modificado no CPF
O laboratório instalação de produção de células em si é bastante padrão e vem equipado com um C congelador -20 °, a -80 ° C freezer, a 4 ° C geladeira, uma centrífuga, e um banho de água. O laboratório também tem uma pia com pedais para operação conveniente mãos livres. Para que este laboratório para se tornar uma unidade de produção de células clínica funcional, no entanto, devem ainda ser feitas várias modificações adicionais. Em primeiro lugar, o aparelho em si tem de ser actualizado para ter a capacidade de monitorar compostos voláteis orgânicos, partículas, e das concentrações de dióxido de cloro que é utilizado para descontaminação. Em segundo lugar, uma câmara de processamento que contém uma máquina de FACS podem ser alojados e ligado ao resto do aparelho através de um módulo de memória intermédia. Isto irá permitir a separação de células e purificação de trpopulações de células ansplantable nas condições ambientais adequadas. Por fim, todo o aparelho deve ser instalado dentro de uma parede macia sala limpa. Isso fornece uma International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente para o aparelho 5.
A alta esterilidade e natureza controlado por computador do CPF faz com que seja um sistema ideal para aplicações futuras com a terapia à base de células e os processos de fabrico boas. O risco de contaminação é bastante atenuados, mas o mais importante, as condições de expansão celular são registados automaticamente e arquivados pelo sistema de computador. Desvios em concentrações de gases, temperatura, umidade e todos os eventos de acesso ao sistema são rigorosamente documentadas. Isso pode ajudar muito na investigação de problemas de qualidade do produto. No entanto, ainda há limitações. O uso de qualquer e todos os reagentes e materiais (por exemplo, componentes de mídia, pipetas, placas) deve ser documentada separadamente. Adicionaritionally, há uma infinidade de problemas potenciais (incluindo muitas formas de erro humano) que podem surgir que são completamente alheios às variáveis documentados pelo sistema de monitoramento do CPF. Assim, a necessidade de pessoal altamente treinado e documentação manual detalhado de tarefas permanece no lugar.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a equipe Biospherix por sua ajuda em aprender a usar o sistema de cultura celular Xvivo fechado, especialmente Matt Freeman; o pessoal do Miles & Kelley Construction Company, Inc. para o seu trabalho na criação da infra-estrutura laboratorial, especialmente Russ Hughes; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Instalações e Serviços de Suporte para o seu trabalho na coordenação da remodelação de laboratório, especialmente Adam Lukhard e Devin Hugie; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Sistemas de Informação pela sua ajuda na criação da infra-estrutura de gerenciamento de dados e acesso remoto, especialmente Viet Tran; Hospital Infantil de Orange County Equipe de Gestão Executiva por seu apoio de longa data do projeto, especialmente Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Este trabalho foi financiado pelo Hospital Infantil de Orange County e do California Institute for Regenerative Medicine através TR3-05476 subvenção para PHS. Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |