Isolering av CD 90+ Fibroblast / Myofibroblaster från Human Frysta Gastrointestinal Prover
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblaster / myofibroblaster (MFS) har allt större uppmärksamhet för sin roll i patogenes och deras bidrag till både sårläkning och främjande av tumören mikromiljö. Det finns för närvarande många tekniker för isolering av MFS av gastrointestinala (GI) vävnader, introducerar detta protokoll ett nytt inslag i isolering av dessa stromaceller från fryst vävnad. Frysning GI vävnadsprover inte bara tillåter forskaren att skaffa prover från hela världen medarbetare, biobanker och kommersiella säljare, också tillåter det den fördröjda behandlingen av färska prover. Den beskrivna protokollet kommer konsekvent att ge karaktäristiska spindelformade celler med MF fenotyp som uttrycker markörerna CD90, α-SMA och vimentin. Eftersom dessa celler är härledda från patientprover, användning av primära celler ger också fördelen av ett nära härmande MFS av sjukdomstillstånd-nämligen cancer och inflammatoriska tarmsjukdomar. Denna teknik har bietn valideras i magsäcken, tunntarmen och kolon MF primär kultur generation. Primära MF kulturer kan användas i ett brett spektrum av experiment under ett antal passage och deras renhet bedöms av både immunocytokemi och flödescytometrianalys.
Introduction
Myofibroblaster / fibroblaster (MFS) utgör en riklig population av celler i mag (GI) slemhinna. Dessa stromaceller ligger precis under epitel och bildar ett sammanhängande nätverk inom mucosal lamina propria i tarmen. MFS är inte bara ansvarig för avsättningen av den extracellulära matrisen, utan genom parakrin reglering kan påverka elektrolyt transport, restitution och barriärfunktionen hos den intilliggande epitel 1, 2. Dessutom har MFS visat sig spela en viktig roll vid inflammation och vävnads remodeling 3, 4. Myofibroblaster är en viktig del av tumören mikromiljö, där de är även känd som cancerassocierade fibroblaster, och bidra till tumörcelltillväxt och fungera som en nisch för cancerstamceller 3. Emerging data tyder på att MFS också kan fungera som lokala antigenpresenterande celler. Dessutom, MFS fungerar som viktiga regulatorer av medfödda och adaptiva immunsvar, producing en mängd olika cytokiner och tillväxtfaktorer 5.
Hos friska individer är MFS-celler tros skilja från mesenkymala stamceller och uttrycker på sin cellyta, den mesenkymala markör, CD90 3, 5. Dessa celler är också positivt för vimentin, men negativt för epitel och hematopoetisk cellmarkör, EpCAM och CD45 , respektive. Myofibroblaster föreslås vara en aktiverad form av fibroblaster och kan särskiljas från icke-aktiverade fibroblaster genom uttryck av α-SMA 5.
Under det senaste årtiondet, flera metoder för isolering av myofibroblaster från humana kolonslemhinnan har publicerats, huvudsakligen baserad på den metod som ursprungligen beskrivits av Mahida et al. 5-8. Även enskilda studier rapporterar isoleringsförfaranden från olika tarmslemhinnan, ingen universal protokoll för isolering av MFS från flera områden i mag-tarmkanalen (dvs, mag-, små och large mukosa) publicerad. Protokollet presenteras här har testats och framgångsrikt använts för alla tre typer av vävnad som nämns ovan. . Dessutom har förfaranden för att isolera MFS från frysta GI slemhinnan inte rapporterats.
Här presenterar vi en optimerad metod, som bygger på enzymatisk digestion, och samtidigt gör det möjligt för isolering av människans tarm mucosal MFs för kultur och flödescytometrianalys i färskt omsatta och enda cell, mucosal preparat. Denna teknik ger ett tillförlitligt primära kulturer med en MF fenotyp. Dessutom kan samma metoder användas för att isolera MFS från frysta exemplar av mag- och små tarm vävnader också. Isolering av myofibroblaster från färsk GI vävnad har tidigare beskrivits; Men användningen av frysta prover ger många fördelar. Nämligen, skulle forskarna kunna samla in och lagra vävnader från valfritt antal medarbetare över hela världen som har capability leverans frusna vävnadsprover. Dessutom kan forskarna hitta insamling av kasserade vävnad från operationssalen och / eller endoskopi svit och omedelbar bearbetning av vävnad för isolering till konflikt med deras nuvarande experiment schema. Dessutom, på grund av den oförutsägbara karaktären av kirurgi, kan vävnadstillvaratagande uppträder mycket sent på dagen, vilket kommer att begränsa tid kvar för bearbetning vävnad. Frysning vävnad för senare bearbetning kommer att förbättra dessa utmaningar.
Slutligen har dessa metoder med framgång använts i isoleringen av kolon, gastriska och små tarm myofibroblaster i sjukdomstillstånd, såsom kolorektalt karcinom och inflammatoriska tarmsjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om detta protokoll har utvecklats för forskningsansökan endast mot bakgrund av ökande avgörande betydelsen av stromaceller som en potentiell cancer prognostic biomarkörer och terapeutiskt mål, förmågan att frysa "funktionella" biospecimens för senare användning erbjuder en betydande fördel. Detta är en unik fördel för att skapa klinisk biorepository, som kan tjäna som ytterligare verktyg som används för att främja utvecklingen av personlig medicin 10, 11. Liknande iakttagelse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
Riferimenti
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
