Taps og Gain-of-funksjon tilnærming for å undersøke Tidlig Cell Fate Determinanter i Før implantasjon Mouse Embryoer
Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en tap-og få-funksjon metode som er aktuelt å identifisere neogenin som en scene-spesifikk reseptor som fører til trophectoderm og indre cellemasse differensiering i preimplantation museembryoer.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Før implantasjon embryoutvikling kan deles inn i flere forskjellige trinn, fra den ene celle-stadiet til morula og blastocyst. Mye tyder på at polariteten og posisjonelle signaler spille en rolle tidlig i cellen skjebne bestemmelse inn i trophectoderm (TE) og den indre cellemasse (ICM). Imidlertid er arten av de signaler, hvor de blir omformet til cellulære signaler, og de fysiologiske sammenhenger hvor slike signaler er i stand til å initiere celle avstamning differensiering er ikke kjent. Disse differensierte celler så gjennomgå fordypning, som begynner å ta på karakteristiske strukturer og funksjoner som er nødvendige for embryo riktig dannelse og vekst av morkaken 1-3.
Før implantasjon embryoer er spesielt mottagelig for manipulering ved direkte injeksjon av endrede genetiske materialer som siRNA eller mål-cDNA, og således kan benyttes for å studere bestemte målmolekyler. Det er en økende forståelse for at genetiskanalyse av virveldyr embryoer er kritisk til å fremme vår forståelse av embryonal utvikling 4. Nøyaktig innføring av en villtype-genet eller en mutant form til et embryo i en riktig sammenheng for å oppnå gevinst-eller tap-av-funksjon av genet har i stor grad studiet av utviklingsmessig regulerte gener. Taps og få-av-funksjon via mikroinjeksjon av genetisk materiale i enkelte tidlige ikke-pattedyr og pattedyr embryoer er relativt enkelt på grunn av sin store størrelse og stor mottakelighet 5. Mikroinjeksjon blir typisk utført ved anvendelse av ikke-virale vektorer. Særlig fordel er tatt av den enkle å bruke ikke-virale vektorer i løpet av virale vektorer og transgener. En rask taps eller gevinst-of-funksjonsuttrykk system i museembryoer har blitt utviklet som tillater oss å dissekere og forstå genet funksjoner i virveldyr embryologi 6,7.
Fluorescent merking av befruktede egg vil i stor grad forenkle valg av microinjected eller genetisk manipulert embryoer og samtidig gi et middel for å kvantifisere indirekte ekspresjonsnivået av mikroinjisert siRNA eller cDNA basert på fluorescerende intensitet 8. For å oppnå dette merking, fluorescerende protein cDNA, GFP eller RFP, er ko-injisert enten som fusjonskonstruksjoner eller separat. Fluorescensintensiteten av GFP eller RFP viser graden av ekspresjon av siRNA eller fremmed DNA for å sikre at taps eller gain-of-funksjon er blitt oppnådd.
Her presenterer vi en micromanipulation protokoll for tap-og gain-of-funksjon teknikk som tillot oss å identifisere neogenin som en reseptor som releer ekstracellulære signaler viktige i begynnelsen av celledifferensiering i preimplantation museembryoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den foreliggende protokollen, viser vi nye metoder for mikroinjeksjon av genetisk materiale, enten cDNA eller shRNA, i 2-PN museembryoer for å undersøke hvilken rolle neogenin tidlig i celledifferensiering under musen embryogenese. Genmodifisering av preimplantation embryoer er en kraftfull teknikk i å avdekke nøkkelinformasjon om underliggende molekylære mekanismer for, for eksempel, den første cellen avstamning besluttsomhet. Genmodifisering er en av de mest brukte metodene for å fastslå gen-funksjon. Med re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker også å erkjenne Dr. Xiong gruppe på Georgia Health Sciences Universitet for produksjon og deling av konstruksjonene for neogenin cDNA og shRNA vektorer. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) finansiert av den koreanske Research Foundation og med et forskningsstipend fra Sahmyook University.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
Riferimenti
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
