Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón
Summary
El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Preimplantación desarrollo embrionario se puede dividir en varias etapas distintas, desde el estadio de una célula a la mórula y blastocisto. Hay mucha evidencia que sugiere que la polaridad y señales posicionales juegan un papel en la determinación precoz del destino celular en el trophectoderm (TE) y la masa celular interna (ICM). Sin embargo, la naturaleza de las señales, la forma en que se transducen en señales celulares, y los contextos fisiológicos en el que dichas señales son capaces de iniciar la diferenciación de linaje de células no son conocidos. Estas células diferenciadas a continuación, se someten a la especialización, comenzando a asumir estructuras características y funciones necesarias para la formación del embrión propiamente dicho y el crecimiento de la placenta 1-3.
embriones de preimplantación son particularmente susceptibles a la manipulación por inyección directa de materiales genéticos modificados como siRNA o ADNc diana y por lo tanto pueden ser utilizados para estudiar moléculas diana específicas. Hay una creciente comprensión de que genéticaanálisis de los embriones de vertebrados es fundamental para avanzar en nuestra comprensión del desarrollo embrionario 4. introducción precisa de un gen de tipo salvaje o una forma mutante en un embrión en un contexto oportuna para llevar a cabo GAIN- o pérdida de la función del gen ha facilitado enormemente el estudio de los genes regulados por el desarrollo. Deficitaria y ganancia de función a través de la microinyección de materiales genéticos en embriones de mamíferos y no mamíferos primeros individuales es relativamente simple debido a su gran tamaño y gran receptividad 5. La microinyección se realiza típicamente usando vectores no virales. Particular se ha hecho uso de la facilidad de uso de vectores no virales sobre vectores virales y transgenes. Una deficitaria rápida o sistema de expresión de ganancia de función en embriones de ratón se ha desarrollado que nos permite diseccionar y entender las funciones de genes en la embriología de los vertebrados 6,7.
el marcaje fluorescente de embriones facilitaría en gran medida la selección de los microinjected o genéticamente embriones manipulados y al mismo tiempo conceder un medio para cuantificar indirectamente el nivel de expresión de siRNA o ADNc microinyección basada en la intensidad fluorescente 8. Para lograr esto etiquetado, ADNc de la proteína fluorescente, GFP o RFP, son co-inyectados ya sea como construcciones de fusión o por separado. La intensidad de fluorescencia de GFP o RFP revela el grado de expresión de siRNA o ADN extraño para asegurar que deficitarias o que se ha logrado ganancia de función.
A continuación, se presenta un protocolo para la micromanipulación técnica función deficitaria y la ganancia-de- que nos permitió identificar neogenin como un receptor que transmite señales extracelulares importantes en la diferenciación celular a principios de preimplantación de embriones de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente protocolo, demostramos nuevos métodos de microinyección de materiales genéticos, ADNc o shRNA, en los embriones de 2 PN ratón para explorar el papel de neogenin en la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana del ratón. La modificación genética de preimplantación de embriones es una técnica de gran alcance en el descubrimiento de información clave sobre los mecanismos subyacentes moleculares para, por ejemplo, la primera determinación del linaje celular. La modificación genét…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores también desean reconocer el grupo del Dr. Xiong en el Georgia Health Sciences University para la fabricación y distribución de los constructos de vectores de ADNc y neogenin shRNA. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Programa Básico de Investigación Científica (2013R1A1A4A01012572), financiado por la Fundación de Investigación de Corea y por una beca de investigación de la Universidad de Sahmyook.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
Riferimenti
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