Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.
Injecteerbare biomaterialen worden gedefinieerd als implanteerbare materialen die in het lichaam als een vloeistof kan worden ingebracht en in situ stollen. Dergelijke materialen bieden klinische voordelen worden geïmplanteerd minimaal invasief en gemakkelijk vorming ruimtevullende vaste deeltjes onregelmatig gevormde defecten. Injecteerbare biomaterialen zijn op grote schaal onderzocht als scaffolds voor tissue engineering. Voor het herstel van bepaalde dragende gebieden van het lichaam, zoals de tussenwervelschijf, steigers moeten hechtende eigenschappen bezitten. Dit zal de kans op dislocatie te minimaliseren tijdens beweging en ervoor innig contact met het omringende weefsel, die voldoende krachtoverdracht. Hier beschrijven we de bereiding en karakterisering van een steiger bestaande uit thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) en alginaat microdeeltjes. De PNIPAAm-g-CS copolymeer vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur, waarin alginate deeltjes gesuspendeerd om de hechting te verbeteren. Boven de onderste kritische oplostemperatuur (LCST), ongeveer 30 ° C, het copolymeer vormt een vaste gel rond de microdeeltjes. We hebben standaard biomaterialen karakterisering procedures aangepast om rekening te houden met de omkeerbare faseovergang van PNIPAAm-G-CS. Resultaten geven aan dat de opname van 50 of 75 mg / ml alginaat deeltjes in 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS oplossingen verviervoudigen de hechtkracht van PNIPAAm-GCS alleen (p <0,05). De opname van alginaatmicrodeeltjes significante toename zwelvermogen van PNIPAAm-G-CS (p <0,05), waardoor een ruimtevullende gel binnen weefseldefecten handhaven. Tenslotte resultaten van de in vitro toxicologie testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) en Live / Dead levensvatbaarheid-assay duiden dat de kleefstof ingezet worden in de overleving en proliferatie van ingekapselde humane embryonale nier (HEK) 293 cells over 5 dagen.
Injecteerbare biomaterialen zijn die gemakkelijk in het lichaam kan worden afgeleverd als een vloeistof en vast in situ. Dergelijke materialen zijn uitgebreid toegepast in de regeneratieve geneeskunde, waar zij worden gebruikt om ingekapselde cellen afleveren op het terrein 1-4 en fungeren als een driedimensionale tijdelijke extracellulaire matrix voor de cellen 5. Voor de patiënt, injecteerbare biomaterialen zijn voordelig omdat de chirurgische procedures voor implantatie zijn minimaal invasieve en de vaste fase kan vullen onregelmatig gevormde weefsel gebreken, waardoor de noodzaak voor aangepast formaat implantaten.
Injecteerbaarheid kan worden bereikt door een verscheidenheid van mechanismen. Externe factoren, zoals pH, werden onderzocht als een trigger voor de vorming van gels die cellen en biologisch actieve moleculen 6-8 kapselen. Evenwel pH niet de meest geschikte trekker te gebruiken in alle fysiologische omgevingen. Een ander traditioneel Alternatief voor het bereiken injecteerbaar is door in situ chemische polymerisatie of verknoping. Een groep ontwikkelde een in water oplosbare redox systeem bestaande uit ammoniumpersulfaat en N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine en gebruikt voor het laten reageren macromeren bestaat uit polyethyleenglycol en poly (propyleen) glycol 9,10. Zan et al. 11 ontwikkelde injecteerbare chitosan netwerken polyvinylalcohol verknoopt met glutaaraldehyd. Bij dergelijke systemen moet de cytotoxiciteit van reactieve componenten worden gehouden, vooral voor toepassingen in celinkapselende. Ook zou exotherme polymerisatie- temperaturen hoog genoeg produceren omringende weefsel, dat is beschreven voor polymeer botcement 12,13 compromitteren.
Nog andere injecteerbare polymere systemen ontwikkeld die een overgang van vloeibare naar vaste toestand met de temperatuur als de trigger vertonen. Bekend als thermogelling systemen, zijn aqueoons polymeeroplossingen die niet behoeft chemische stimulus, monomeren, verknopingsmiddelen of bereiken in situ vorming 14. Eerder een faseovergang zich doorgaans dichtbij fysiologische temperatuur induceert de vorming van een fysisch verknoopt driedimensionaal netwerk. Poloxameren zoals Pluronic F127 behoren tot de meest bestudeerde polymeren voor geneesmiddelafgifte thermogelling 15-17 en celinkapselende 18,19. Het is echter algemeen geaccepteerd dat deze gelen in aan stabiliteit fysiologische omstandigheden. Studies hebben een verhoogde stabiliteit aangetoond met behulp van ketenverlengers 20 of chemische crosslinkers 21,22. Niettemin kan het gebruik van deze reagentia de mogelijkheden van het materiaal voor celinkapselende beperken.
Poly (N-isopropylacrylamide) is een synthetisch polymeer thermogelling dat veel aandacht heeft gekregen in tissue engineering en drug delivery 14. Waterige oplossingen van poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) vertonen een lagere kritische temperatuur-oplossing (LCST), typisch optredende rond 32-34 ° C 23,24. Onder de LCST, water hydrateert PNIPAAm ketens. Boven de overgangstemperatuur, wordt het polymeer hydrofobe, wat resulteert in een dramatische fasescheiding 25-27 en de vorming van een vaste gel zonder het gebruik van toxische monomeren en verknopingsmiddelen. Echter, PNIPAAm homopolymeren vertonen slechte elastische eigenschappen en houden weinig water bij fysiologische temperatuur te wijten aan hydrofobiciteit 28. In dit werk, kiezen we chondroïtinesulfaat covalent nemen in de PNIPAAm netwerk, dat het potentieel voor enzymatische afbraak 29, anti-ontstekingsactiviteit 30,31 en verhoogde water- en voedingsopname 32 biedt. PNIPAAm copolymeren CS werden in ons laboratorium bereid door polymeriseren van het monomeer NIPAAm in aanwezigheid van methacrylaat-gefunctionaliseerde CS entcopolymeer (PNIPAAm-g-CS) te vormen. BecAGebruik de lage verknopingsdichtheid van het copolymeer, PNIPAAm-G-CS vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur en een elastische gel bij fysiologische temperatuur dankzij het LCST 29. De polymeeroplossingen worden vloeiend weer na afkoeling onder de LCST als gevolg van de omkeerbaarheid van de overgang.
We hebben aangetoond dat PNIPAAm-g-CS heeft de potentie om te functioneren als een scaffold tissue engineering, door mechanische eigenschappen die kunnen worden aangepast, afbreekbaarheid en cytocompatibility met menselijke embryonale nier (HEK) 293-cellen 29. In bepaalde dragende gebieden, zoals de tussenwervelschijf, tissue engineering scaffolds moet in staat zijn een aanzienlijke interface disc omringende weefsel te vormen om het risico van ontwrichting 33 te elimineren. Deze interface is ook noodzakelijk voor een adequate krachtoverbrenging over het grensvlak tussen het implantaat en het weefsel 33. In ons werk, hebben we een opgeschortlginate microdeeltjes in waterige oplossingen van PNIPAAm-G-CS en vond dat geleren lokaliseert de microdeeltjes, die de hechting met het omliggende weefsel 34. In dit artikel schetsen we de stappen voor de voorbereiding van de thermogelling, zelfklevende polymeer. Standaardtechnieken voor biomaterialen en karakterisatie, cell imaging en assays voor levensvatbaarheid werden aangepast om rekening te houden met de temperatuurgevoeligheid van het polymeer en de omkeerbaarheid van de faseovergang. De injecteerbare polymeer beschreven in dit document heeft ruime mogelijkheden voor drug delivery en tissue engineering-toepassingen buiten de in dit document beschreven. Bovendien kan de karakterisering werkwijzen beschreven voor andere thermogelling systemen.
Er zijn verschillende kritische stappen in de synthese van de hydrogel micropartikels composiet en evalueren van de hechtsterkte, zwelling vermogen en cellulaire biocompatibiliteit. Vrije radicaalpolymerisatie van PNIPAAm-G-CS vereist een succesvolle methacrylation chondroïtinesulfaat, volledige oplossing van monomeercomponenten en zuurstofvrije reactiecondities. De verhouding van monomeer tot NIPAAm methacrylbevattend chondroitin sulfaat in het reactiemengsel werd gekozen omdat is aangetoond, in ons eerder werk copoly…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de hulp van Dr. Jennifer Kadlowec dankbaar erkennen in de ontwikkeling van de lijm trekproef protocol.
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten en het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering van de National Institutes of Health onder Award Number 1R15 AR 063920-01. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
Rocking platform | VWR | Series 100 | |
Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |