High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em> Arabidopsis</em> Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
Plantecellevæggen er en dynamisk struktur. Voksende celler er omgivet af en primær cellevæg, den organisation, som tillader celler at ekspandere. Celler, som ophører med at vokse indskud en mere stiv sekundær væg, der forbedrer den mekaniske støtte for planten. Begge cellevægge er sammensat af cellulosemikrofibriller indlejret i en matrix af polysaccharider af forskellige strukturer (fx hemicellulose og pektin), der varierer på tværs af forskellige udviklingstrin og væv 1,2. Cellulose syntetiseres som kæder af (1,4) -β-D-glucan, der er tæt på linie til dannelse af microfibril af en krystallinsk struktur. Amorf cellulose refererer til de regioner, hvor de glucankæder er mindre bestilt. Forholdet mellem den krystallinske og amorfe domæner er en parameter menes at påvirke de mekaniske egenskaber af cellevæggen, ved at give mekanisk styrke og viskoelastiske egenskab, henholdsvis 3. Adskillige fremgangsmåder har væretudviklet til at detektere og kvantificere de to former af cellulose arrangement, blandt dem røntgendiffraktion og cross polarisering / magic vinkel spinning faststof NMR 4. Røntgendiffraktion kan anvendes til at bestemme andelen af krystallinsk versus amorfe cellulose- domæner i prøven 5. En alternativ fremgangsmåde anvender fraktionering af cellevæggen indhold i syre-uopløselige og syre-opløseligt materiale, til at skelne mellem den krystallinske og amorfe cellulose eller andre polymerer, henholdsvis. I denne fremgangsmåde er inkorporering af mærket glucose ([14C] glucose) anvendes til at kvantificere cellulose 6,7. Disse metoder kræver store mængder af plantemateriale til helorgan analyser i bedste, og derfor er utilstrækkeligt følsomme for vævsspecifik variation i cellevæggen struktur. Visualisering af cellulosemikrofibriller på celleniveau opløsning kan opnås i levende billeddiagnostiske undersøgelser kombineret med fluorescerende farvestoffer 8,9, der kan identificere ændringer iorienteringen af cellulosemikrofibriller. Imidlertid er disse farvestoffer ikke anvendes til kvantificering, de er ikke specifikke for krystallinsk cellulose og kan forstyrre den normale struktur af cellevæggen 8. Polscope er et billeddannende teknik, der bygger på evnen af krystallinsk cellulose opdele lysstråler og retardere del af lyset 10. Lys retardering er stærkest for mikrofibriller, der ligger vinkelret på retningen af lys formering. For mikrofibriller med tilsvarende orientering, jo højere grad af krystallinitet, jo større lys retardance 11. Derfor er polscope anvendt til at undersøge både de relative niveauer og orientering af cellulosemikrofibriller.
Rødder udviser lineær vækst, under hvilken cellerne oprindelse på stamcellen niche, ved spidsen af roden, gennemgå en række celledelinger, før de hurtigt at udvide 12. De celler, der omfatter roden ekspandere i en ensrettet (anisotropisk)måde, som dikteret af småmolekylære signalering hormoner, der påvirker egenskaberne af cellevæggen 13. Differential reaktioner på hormoner, i tid og rum, et middel til at sikre vækst balanceret organ 14. Derfor kan høj opløsning analyse af cellevæg struktur give vigtige oplysninger er nødvendige for bedre at forstå sammenhængen mellem celle typespecifikke reaktioner på hele vækst orgel. Her rapporterer vi gennemførelsen af polscope at studere vævsspecifik akkumulering af krystallinsk cellulose i Arabidopsis rødder, som observeret i høj kvalitet anatomiske sektioner. Denne metode nylig afsløret celletype-specifik akkumulering af krystallinsk cellulose som reaktion på fysisk forstyrrelse af hormonelle aktivitet 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenteres en fremgangsmåde til bestemmelse af akkumuleringen af krystallinsk cellulose i de forskellige væv, der udgør Arabidopsis rødder, og samtidig opretholde anatomiske oplysninger. Som sådan tilvejebringer et yderligere trin til at forstå vækstprocesser i planter på en cellulær opløsning. Denne metode kan også anvendes til undersøgelse af yderligere plantearter og organer.
En række punkter skal overvejes ved anvendelsen af metoden. Første, krystallins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
