SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde
Summary
Bu işlem, bir sulu çözelti içinde, protein biyomoleküllerin yerinde time-of-flight sekonder iyon kitle spektrometrisi analizi için bir mikrokanal sıvı kullanım ve numune girişi için bir protokol sunulur.
Abstract
Bu çalışma Sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) ve (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi de Analiz Sistemi kullanılarak sulu çözeltide protein biyomoleküllerin yerinde karakterizasyonu göstermektedir. fibronektin, protein filmi SALVI algılama alanı oluşturan silisyum nitrür (SİN) zar üzerinde hareketsizleştirildi. TOF-SIMS analizi sırasında, analizin üç modu, yüksek uzaysal çözünürlüğü kütle spektrometresi, iki boyutlu (2D) görüntüleme ve derinlik profilleme dahil yapılmıştır. Kütle spektrumları pozitif ve negatif modda hem de elde edildi. Deiyonize su, bir referans örnek olarak analiz edildi. Bizim sonuçları suda fibronektin filmi tek başına suya göre daha belirgin ve güçlü su küme zirveleri olduğunu göstermektedir. amino asit parçalarının karakteristik zirveleri de sulandırılmış protein TOF-SIMS spektrumları içinde gözlemlenebilir. Bu sonuçlar, bir yüzey üzerine bir protein molekülünün adsorpsiyon Dynamica incelenebilir olduğunu göstermektedirLly ilk kez sıvı ortamda Salvi ve TOF-SIMS kullanarak.
Introduction
Hidrasyon yapısı, 1 konformasyon, 2 ve proteinlerinin biyolojik aktivitesi 3 için çok önemlidir. onları çevreleyen su molekülleri olmaksızın Proteinler canlı biyolojik aktiviteleri olmazdı. Özellikle, su molekülleri yüzey ve proteinlerin iç yapısı ile etkileşim ve proteinlerin farklı hidrasyon durumları farklı tür etkileşimleri yapmak. 4 katı yüzeyler ile proteinlerin etkileşim nanoteknoloji, biyomalzeme ve doku mühendisliği süreçlerinde etkileri olan temel bir olgudur. Çalışmalar, uzun bir protein, bir yüzey ile karşılaştığında olarak yapısal değişiklikler meydana gelebilir göstermiştir. TOF-SIMS protein katı arayüzü çalışma potansiyeline sahip teknik olarak tasavvur edilmiştir. 5-7 Potansiyel kendi yapısının mekanizmasının temel bir anlayış sağlar katı yüzeyler, proteinlerin hidrasyon anlamak önemlidir, konformasyon ve biyolojikark aktivitesi.
Bununla birlikte, ana yüzey analitik teknikler çoğunlukla vakum tabanlıdır ve uçucu sıvı çalışmalar için doğrudan uygulamalar bağlı vakum ortamında uçucu sıvı hızlı buharlaştırma zordur. Biz sıvı yüzeyler ve sıvı-katı etkileşimleri (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi kullanarak doğrudan gözlemler sağlamak için, sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) at Analiz, uyumlu mikroakışkan arayüz Sistemi bir vakum geliştirdi. 8- 2) yüzey gerilimi, diyafram içinde sıvı tutmak için kullanılan 1) tespit penceresi sıvı yüzeyinin doğrudan görüntüleyebilen ve çapı 2-3 mikron bir açıklık ve 3) SALVI: 11 benzersiz özellikleri aşağıdakileri içerir birden fazla analitik platformlar arasında taşınabilir. 11,12
SALVI algılama alanı ve polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikrokanal bir silisyum nitrür (SİN) membran oluşur. Bu Fabr olduğunuTemiz oda gili ve imalat ve temel tasarım faktörleri önceki gazetelerde ve patent ayrıntılı edilmiştir. 8-12 analitik bir araç olarak TOF-SIMS uygulamaları bazı sulu çözeltilerde ve karmaşık sıvı karışımlarının, kullanarak çeşitli gösterildi hangi nanopartiküller içeriyordu. 13-17 Özellikle, SALVI sıvı TOF-SIMS yerinde yoğunlaştırılmış aşamasında yeni fırsatlar açarak, canlı biyolojik sistemlerin (yani, biyofilm), tek hücreler ve katı-elektrolit arayüzünün sıvı-katı arayüzü sondalama dinamik veriyor TOF-SIMS kullanarak sıvılar dahil çalışmalar. Bununla birlikte, mevcut tasarım henüz gaz-sıvı etkileşimleri izin vermez. Bu gelecekteki gelişimi için bir yönüdür. SALVI ilk kez bu çalışmada hidratlanmış bir protein filmi incelemek için kullanılmıştır.
Fibronektin iki hemen hemen aynı disülfid bağları bir çift bağlı monomerler, 18 oluşan bir yaygın olarak kullanılan protein dimeri olan Ihücreleri bağlanma yeteneği için iyi bilinmektedir. Bu bir model sistem olarak seçildi 19,20 hidratlanmış bir protein filmi dinamik SALVI sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanılarak sondalanabilir ki göstermek için. Protein çözeltisi, mikrokanal sokuldu. 12 saat inkübe edildikten sonra, bir hidratlı bir protein filmi SıN membran arka tarafında oluşturulmuş. Deiyonize (DI) su, protein girmesinden sonra kanal durulayın kullanıldı. Bilgi dinamik TOF-SIMS kullanarak SALVI mikrokanalda hidratlı fibronektin protein molekülleri toplanmıştır. DI su da hidrate fibronektin ince film elde edilen sonuçlarla karşılaştırmak için bir kontrol olarak çalışıldı. Belirgin farklılıklar sulandırılmış protein film ve DI su arasında gözlendi. Bu çalışma, sıvı ortamda yüzeyde protein adsorpsiyon roman salvi ve sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanarak okudu edilebileceğini göstermektedir. video protokol ilgilenen kişiler için teknik rehberlik sağlamak için tasarlanmıştırTOF-SIMS ile Salvi farklı uygulamalar için bu yeni analitik aracı kullanan ve TOF-SIMS veri toplama ve analiz yanı sıra sıvı taşıma gereksiz hatalar azaltmak içinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI gibi TOF-SIMS ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) olarak vakum temelli araçların dinamik sıvı yüzey ve sıvı-katı ara analizine olanak sağlayan bir mikroakışkan arabirimdir. Küçük delikler kullanımı doğrudan vakum sıvı açığa nedeniyle SALVI herhangi bir değişiklik olmadan birçok ince odaklı spektroskopi ve görüntüleme teknikleri için uygundur; 22 taşınabilirlik ve Mikroakiskan çok yönlülüğü gerçek bir multimodal görüntüleme platformu yapmak. Farklı özellikle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
Riferimenti
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
