Nye beregninger for å karakter Embryonic Forlengelse av nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
I nesten 50 år har nematode Caenorhabditis elegans etablert seg som en kraftig modell for å studere viktige spørsmål innen utvikling, nevrobiologi, evolusjon, host-patogen interaksjoner, etc. en Styrken av denne modellen i studiet av utvikling ligger i: sin korte levetid 3 dager; den enkle som disse dyrene kan være genetisk endret; sin åpenhet som gjør det mulig observasjon av cellen forskyvning og morfologi i levende dyr og sin utvikling som er mest livmoren. Utviklingsstadier av nematode involvere embryogenese og fire larvestadier (L1 til L4), etterfulgt av voksenlivet. Under embryonal utvikling, epidermal morphogenesis trakk mye oppmerksomhet for sin evne til å muliggjøre en bedre forståelse av hvordan epitelceller migrere som en gruppe, hvor de reorganisere sine veikryss og endre deres individuelle morfologi samt deres relative posisjonering innenfor en funksjonell epitel.Epidermal morfogenese er delt inn i fire faser: dorsal innskyting består i omorganisering av dorsal epidermale celler, referert til som hypodermis; ventral kabinett, som består i migrasjon av ventral hypodermal celler mot ventrale midtlinjen og dermed encasing embryo i en epitelial celle monolag; tidlig og sent forlengelse trans bønne-formet embryo i vermiform larver. Etter morphogenesis, embryo luke og L1 larver startfôring ved hjelp av tilgjengelige bakterier i nærmiljøet.
Embryonale forlengelse er derfor en sen fase av embryoutvikling. Den består av en forlengelse av embryoet langs sin lengdeakse og en reduksjon av dets tverr diameter. Dette innebærer en dramatisk endring av formen på hypodermal cellene. Forlengelse er delt i en tidlig og sen fase. Den tidlige fasen starter ved komma scenen og slutter når kroppen veggen muskler begynner kontrahering på 1,75 ganger stadium i wILS-(vekt) embryoer – tilsvarende embryoer som er 1,75 ganger i lengde sammenlignet med ikke-langstrakt embryoer. Morphogenic prosesser som skjer på det stadiet er hovedsakelig drevet av sammentrekning av trådformede aktin bunter (FBS) ligger på den apikale polen hypodermal celler som driver sin forlengelse langs Antero-posterior aksen av embryoet to. Sammentrekning av fremmedlegemer er kontroll ved fosforylering av myosin-lys kjeder av tre kinaser LET-502 / rock, MRCK-en og PAK-en fem. Den sen fase av forlengelse, starter når kroppen-vegg musklene blir funksjonell og starte entreprenørselskap. Det innebærer mechanotransduction signalering fra kroppen veggen muskler til dorsal og ventral hypodermal celler og slutter når dyrene klekkes tre.
Forlengelse defekter er generelt preget av prosentandelen av dyr som dør som embryoer (Embryonic dødelighet, Emb) og de arrestere deres utvikling som L1 larver (Larve arrest fenotype; Lva) og er vesentlig kortere enn vekt. Identifikasjon av scenen av utviklings arrest krever mikroskopisk observasjon av døde fostre og arresterte Larver 3-6.
Det ble nylig vist at flere gener, slik som Cdc42 / Rac regulator og effektor pix-1 og pak-1, kontrollerer morphogenic prosesser under både tidlig og sen forlengelse 3,7. Vi har også nylig viste at morphogenic prosesser forskjellig langs Antero-posterior aksen av embryoene under tidlig forlengelse 3 7. Disse funnene motivert utvikling av nye beregninger spesifikt rettet mot tidlig eller sent forlengelsesfasen og andre beregninger som muliggjør karakterisering av morfologi av befruktede egg langs deres Antero-posterior aksen under tidlig forlengelse.
Disse nye metoder består i å måle lengden av embryoer ved begynnelsen og ved slutten av tidlig forlengelse, så vel som bredden av deres hanannonser og haler. 7 To protokoller ble også utviklet for å måle lengden på nyklekte larver, synkronisert på L1 scenen 7.
De eggeskall av embryoene beskytte dem mot alkalisk hypokloritt-behandling, mens larver, voksne og bakterier som er tilstede i kulturmediet oppløses ved behandlingen. Denne behandlingen blir så brukt til å rense embryoer fra en ikke-synkronisert populasjon inneholdende et flertall av brønn-matet voksne 8. Mat begrensning brukes til å synkron nyklekkede larver. Måle lengden av disse larver blir så brukt for å detektere forlengelses defekter. Denne målingen er foretrukket fremfor måling av arrestert larver på kulturplater fordi larver som klekkes fra ikke-fullt langstrakte embryo kan komme til "normal lengde" når det mates inn, men vil opprettholde deres reduserte størrelse når arrestert i fravær av mat.
Her presenterer vi detaljerte protokoller som muliggjør måling av length til en forlengelse embryoer samt bredden på hodet og halen som bruker time-lapse DIC mikroskopi og bildeanalyse (protokoll 1). Vi gir også detaljerte protokoller for å måle lengden på synkronisert larver å bruke bildeanalyse (protokoll 2) og Flow-Cytometry (protokoll 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver romanen beregninger for å karakterisere tidlig og sent faser av embryonale forlengelse.
I del 1, er det avgjørende skritt mulig tilstedeværelse av bakterier på puten. Embryoene er hermetisk lukket mellom puten og dekkglass under bildet oppkjøpet. Tetting lysbildet er nødvendig for å unngå uttørking av dyrene under oppkjøpet som varer mer enn to timer. Så vidt vi vet, ingen av selfangere som brukes til å montere agarose pads mellom sklie og dekk er luft…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetica. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetica. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
