Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.
La rapida proliferazione delle cellule, l'espressione tessuto-specifica di geni e la nascita di reti di segnalazione caratterizzano sviluppo embrionale precoce di tutti i vertebrati. La cinetica e la posizione dei segnali – anche all'interno di singole cellule – negli embrioni integra l'identificazione di importanti geni dello sviluppo. tecniche di immunoistochimica sono descritte che hanno dimostrato di definire la cinetica di segnali intracellulari animali e intere in strutture piccole come cilia primaria. Le tecniche per il fissaggio, di imaging e di elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio a scansione laser confocale composto può essere completato in soli 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) è un organismo desiderabile per gli investigatori che cercano di condurre studi in una specie di vertebrati che è conveniente e rilevanti per le malattie umane. ko genetica o abbattimenti devono essere confermati dalla perdita del prodotto proteico reale. Tale conferma della perdita di proteinepuò essere realizzato utilizzando le tecniche descritte qui. Gli indizi in vie di segnalazione possono essere decifrati utilizzando anticorpi che sono reattivi con le proteine che sono stati post-traduzionali modificati dalla fosforilazione. Preservare e ottimizzare lo stato fosforilato di un epitopo è quindi fondamentale per questa determinazione e si realizza con questo protocollo.
Questo studio descrive tecniche per risolvere embrioni durante il primo 72 hr di sviluppo e co-localizzare una varietà di epitopi rilevanti con cilia nella zona di Kupffer Vesicle (KV), il rene e l'orecchio interno. Queste tecniche sono semplici, non richiedono la dissezione e può essere completato in un periodo relativamente breve di tempo. Proiezione pile di immagini confocale in una singola immagine è un mezzo utile per la presentazione di questi dati.
The techniques described here are the outcome of studies that have sought to define downstream targets of Ca2+ signals during events that occur during early development, including fertilization, gastrulation, somitogenesis and trunk, eye, brain and organ formation.1-3 The original discoveries of embryonic Ca2+ signaling were dependent on the use of natural and engineered Ca2+ indicators, such as aequorin4 and fura-2.5 Even with current technology, the detection of transient elevations of Ca2+ requires cumbersome analytical tools and does not reveal the targets of such Ca2+ signals.
This laboratory investigates Ca2+ signals that act through the Ca2+/calmodulin-dependent (multifunctional) protein kinase known as CaMK-II, an enzyme that is enriched in the central nervous system and originally identified as a regulator of long-term potentiation.6 CaMK-II is not brain-specific, is widely expressed and highly conserved throughout the entire lifespan and bodies of species throughout the animal kingdom, including invertebrates.7,8 CaMK-II has the unique capability of sustaining its own activity even after Ca2+ levels have diminished due to its ability to autophosphorylate at Thr287. In this autophosphorylated state, CaMK-II remains active in a Ca2+/CaM-independent manner, until dephosphorylated.6 Thus, the localization of phosphorylated CaMK-II (Thr287) can identify cells in which natural, relevant Ca2+ elevations have occurred.
An antibody against autophosphorylated (P-Thr287) mammalian CaMK-II has been well-characterized and was initially used to localize activated CaMK-II in brain tissue.9 Zebrafish (Danio rerio) have seven CaMK-II genes10,11 whose protein products contain a sequence of MHRQE[pT287]VECLK in this region.10,11 This sequence is very similar to the phosphopeptide antigen used to create this rabbit polyclonal antibody (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) and therefore it was not a complete surprise that this antibody cross-reacted with zebrafish CaMK-II. This laboratory showed that this antibody reacts with zebrafish CaMK-II in proportion to autophosphorylation and Ca2+/CaM-independent activity.12 Additional pan-specific CaMK-II antibodies have also been shown to cross-react with zebrafish CaMK-II.13
This antibody has been used to demonstrate that zebrafish CaMK-II is preferentially activated in cells on one side of the zebrafish Kupffer’s Vesicle (KV), the ciliated organ necessary for establishment of left/right asymmetry.12 This antibody was used to demonstrate that CaMK-II is transiently activated in four adjacent cells on the left side of the KV during the exact same developmental phase that organ positioning is determined.12 In addition to the Kupffer’s Vesicle (KV), autophosphorylated (P-T287) was also located in specific intracellular sites in other ciliated tissues including the kidney, neuromasts, and inner ear.12,13 In the zebrafish kidney, P-T287-CaMK-II is enriched along the apical border of ciliated ductal cells and within cloacal cilia where it influences their assembly.13 Finally, in the developing inner ear, P-T287-CaMK-II is intensely concentrated at the base of cilia and influences cell differentiation through the Delta-Notch signal pathway.14 In summary, the detection of activated CaMK-II has pinpointed sites of intracellular Ca2+ release and illuminated potential new signaling pathways.
These discoveries were completely dependent on developing a sensitive and accurate method to localize activated (P-T287-autophosphorylated) CaMK-II. The methods to fix and immunostain the zebrafish KV, kidney and inner ear are described. The limitations of this technique are also described. These techniques should be useful to any investigator who seeks to obtain high-resolution images in two fluorescent channels of not just phospho-epitopes, but any epitope, during early vertebrate development.
Il metodo / metanolo PFA è stato sviluppato in questo laboratorio con l'obiettivo primario di ottimizzare la immunolocalizzazione del fosfo-T 287 -CaMK-II epitopi durante lo sviluppo zebrafish. Questo metodo localizzato successo P-CaMK-II durante la formazione di diversi organi ciliati compreso il KV zebrafish, 12 orecchio interno 14 e reni. 13 In particolare nella fase KV, questa tecnica era necessario. Il successo di questo metodo è probabilmente dovuto ad una combinaz…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation IOS-0.817.658.
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
anti-acetylated a-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1ml tubes, store in freezer |
Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10X stock solution or made in lab |
Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at room temp |
Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at room temp |
Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |