संयंत्र दीवार Heteroxylans का अनुक्रमण Enzymic, रासायनिक (मेथिलिकरण) और शारीरिक (मास स्पेक्ट्रोमेट्री, परमाणु चुंबकीय अनुनाद) तकनीकों का प्रयोग
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
इस प्रोटोकॉल विशिष्ट अंत (आरई) और heteroxylans के आंतरिक क्षेत्र glycosyl अनुक्रम (ओं) को कम करने के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल की तकनीक का वर्णन है। डी-रस्मी गेहूं एण्डोस्पर्म सेल दीवारों एक शराब अघुलनशील अवशेषों (एआईआर) 1 और क्रमिक रूप से पानी (डब्ल्यू-प फादर) के साथ निकाली गई और 1 एम KOH 1% NaBH 4 (KOH-प फादर) युक्त रूप रत्नायके एट द्वारा वर्णित के रूप में अलग थे अल। (2014) 2। दो अलग अलग दृष्टिकोण (चित्रा 1 में सारांश देखें) अपनाया जाता है। पहले में, अक्षत डब्ल्यू प AXS मूल आरई रीढ़ श्रृंखला चीनी अवशेषों को टैग करने 2AB के साथ इलाज किया और फिर एक endoxylanase के साथ इलाज किया 2AB लेबल आरई और आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides क्रमश: कम करने का एक मिश्रण उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। एक दूसरे दृष्टिकोण में, कोह-प फादर endoxylanase साथ hydrolyzed है पहले oligosaccharides जो बाद में 2AB के साथ चिह्नित कर रहे हैं का एक मिश्रण उत्पन्न करते हैं। enzymically जारी ((संयुक्त राष्ट्र) में टैग) दोनों से oligosaccharidesडब्ल्यू और कोह-प Frs तो methylated और दोनों देशी और मिथाइल oligosaccharides की विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण MALDI-TOF एमएस, आरपी-एचपीएलसी-ईएसआई-QTOF-एमएस और ईएसआई एमएस n का एक संयोजन का उपयोग किया जाता है। Endoxylanase पचा KOH-प AXS भी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) भी है कि anomeric विन्यास बारे में जानकारी प्रदान की विशेषता है। इन तकनीकों में उचित एंडो-हाइड्रोलिसिस का उपयोग कर polysaccharides के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
Heteroxylans polysaccharides कि घास के प्राथमिक दीवारों और सभी वनस्पतियों 3-6 के माध्यमिक दीवारों का प्रमुख गैर cellulosic polysaccharides हैं के एक परिवार के हैं। Xylan अनिवार्य जरूरतों उनके प्रकार और glycosyl (glucuronic एसिड (GlcA), arabinose (Araf)) और गैर-glycosyl (ओ-एसिटाइल, ferulic एसिड) ऊतक प्रकार, विकास मंच और प्रजातियों के आधार पर 7 अवशेषों के साथ प्रतिस्थापन के पैटर्न में मतभेद है।
गेहूं से दीवारों (ट्रिटिकम aestivum एल) एण्डोस्पर्म मुख्य रूप से arabinoxylans (AXS) (70%) और (1 → 3) से बना रहे हैं (1 → 4) -β-D-glucans (20%) सेलूलोज और heteromannans की मामूली मात्रा के साथ (2% प्रत्येक) 8। xylan रीढ़ विभिन्न संयुक्त राष्ट्र के एवजी और मुख्य रूप से मोनो प्रतिस्थापित (मुख्य रूप से O-2 की स्थिति है और एक हद तक कम करने हे -3 स्थिति) और di-प्रतिस्थापित α एल आरा के साथ (ओ -2 और हे-3 पदों) हो सकता है एफ अवशेषों 9। को कम करने के अंत (आरई) असमलैंगिक कीडाइकोटों से xylans (उदाहरण के लिए, Arabidopsis thaliana) 10 और जिम्नोस्पर्म (उदाहरण के लिए, सजाना (Picea एबीस)) 11 एक विशेषता tetrasaccharide glycosyl अनुक्रम होता है; -β-D-Xyl पी – (1 → 3) -α एल Rha पी – (1 → 2) -α-D-लड़की पी ए (1 → 4) डी-Xyl पी। heteroxylan जैवसंश्लेषण और समारोह (जैविक और औद्योगिक) को समझते हैं, यह पूरी तरह से प्रकार और प्रतिस्थापन के पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से कम करने के अंत (आरई) के अनुक्रम को समझने के लिए रीढ़ की हड्डी xylan अनुक्रम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
अंत (आरई) और heteroxylans के आंतरिक क्षेत्र glycosyl अनुक्रम (ओं) को कम करने के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल विशिष्ट तकनीक इस पांडुलिपि में वर्णित हैं। तकनीक fluorophore टैगिंग पर भरोसा heteroxylan श्रृंखला एंजाइमी (endoxylanase) हाइड्रोलिसिस से पहले कम करने के अंत (आरई) (2 aminobenzamide (2AB) के साथ)। यह दृष्टिकोण, विशेष रूप से आरई अनुक्रमण के लिए किया गया था,पहले यॉर्क प्रयोगशाला 10,12-13 द्वारा सूचना दी, लेकिन अब आंतरिक क्षेत्र अनुक्रमण शामिल करने के लिए बढ़ाया और है की स्थापना की तकनीकों का एक संयोजन है कि समान रूप से अलगाव के अपने स्रोत के स्वतंत्र सब heteroxylans के लिए अनुकूल है। यह दृष्टिकोण भी (जहां उपलब्ध हो) उचित एंडो-हाइड्रोलिसिस का उपयोग कर polysaccharides के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, de-रस्मी गेहूं एण्डोस्पर्म सेल दीवारों के रूप में वर्णित एक शराब अघुलनशील अवशेषों (एआईआर) और क्रमिक रूप से पानी (डब्ल्यू-प फादर) के साथ निकाली रूप में अलग थे और 1M KOH युक्त 1% NaBH 4 (KOH-प फादर) रत्नायके में एट अल। (2014) 2। दोनों डब्ल्यू और कोह-प Frs से रिहा oligosaccharides तो methylated और दोनों देशी और मिथाइल oligosaccharides की विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण MALDI-TOF एमएस, साथ एचपीएलसी साथ ईएसआई-QTOF-MS-युग्मित का एक संयोजन का उपयोग किया जाता है ऑनलाइन chromatographic जुदाई एक आरपी सी -18 स्तंभ का उपयोगऔर ईएसआई एमएस एन। Endoxylanase पचा KOH-प AXS भी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) की विशेषता थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
अधिकांश मैट्रिक्स चरण कोशिका दीवार polysaccharides मालूम होता है बेतरतीब ढंग से कि अत्यधिक चर रहे प्रजातियों के पौधे, विकास मंच और ऊतक प्रकार 3 पर निर्भर करता है (दोनों glycosyl और गैर-glycosyl अवशेषों के साथ) प्रतिस्था?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
Riferimenti
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