Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Questo protocollo descrive le specifiche tecniche utilizzate per la caratterizzazione di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans. De-inamidate pareti cellulari grano endosperma sono stati isolati come un residuo di alcool-solubile (AIR) 1 e in sequenza estratta con acqua (W-sol Fr) e 1 M KOH contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto da Ratnayake et al. (2014) 2. Due approcci diversi (vedi sintesi in figura 1) vengono adottati. Nel primo, intatti AX W-sol sono trattati con 2AB codificare il RE backbone residuo originale zucchero catena e poi trattati con un dell'endoxilanasi per generare una miscela di RE 2AB marcato e regione interna riducendo oligosaccaridi, rispettivamente. In un secondo approccio, il KOH-sol Fr viene idrolizzato con dell'endoxilanasi per generare prima una miscela di oligosaccaridi che vengono successivamente etichettati con 2AB. I enzimaticamente rilasciati ((ONU) con tag) oligosaccaridi da entrambiW- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata di entrambi gli oligosaccaridi nativi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS e ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito Koh-sol AX si caratterizzano anche per la risonanza magnetica nucleare (NMR) che fornisce anche informazioni sulla configurazione anomerico. Queste tecniche possono essere applicate ad altre classi di polisaccaridi utilizzando le appropriate endo-idrolasi.
Introduction
Heteroxylans sono una famiglia di polisaccaridi che sono i polisaccaridi predominanti non cellulosici delle pareti primarie di erbe e pareti secondaria di tutti angiosperme 3-6. Le dorsali Xylan si differenziano per i loro tipi e modelli di sostituzione con glicosil (acido glucuronico (GlcA), arabinosio (Araf)) e residui seconda tipo di tessuto, stadio di sviluppo e le specie 7 non glicosil (O-acetil, acido ferulico).
Le pareti di grano (Triticum aestivum L.) endosperma sono composti principalmente da arabinoxilani (AXS) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) -β glucani-D-(20%) con piccole quantità di cellulosa e heteromannans (2% ciascuno) 8. La dorsale xilano può essere variamente un-sostituito e prevalentemente mono-sostituito (principalmente O-2 posizioni e, in misura minore, O-3 posizioni) e (O-2 e O-3 posizioni) con α-L-Ara disostituito f residui 9. La fine di ridurre (RE) di eteroxilani da dicotiledoni (ad esempio, Arabidopsis thaliana) 10 e gimnosperme (ad esempio, abete rosso (Picea abies)) 11 contiene una caratteristica sequenza tetrasaccaride glycosyl; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Per comprendere biosintesi e funzione (biologici ed industriali) heteroxylan, è importante sequenziare completamente backbone xilano di comprendere i tipi e modelli di sostituzione nonché la sequenza dell'estremità riducente (RE).
Tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans sono descritti in questo manoscritto. Le tecniche si basano su fluoroforo tagging (con 2 aminobenzamide (2AB)) all'estremità riducente (RE) della catena heteroxylan prima enzimatica (dell'endoxilanasi) idrolisi. Questo approccio, in particolare per il sequenziamento RE, siaprima riportato dal laboratorio York 10,12-13 ma viene esteso per includere la sequenza regione interna ed è una combinazione di tecniche consolidate che è ugualmente adattabile a tutti heteroxylans indipendenti della loro fonte di isolamento. Questo approccio può essere applicato anche ad altre classi di polisaccaridi utilizzando (dove disponibile) le opportune endo-idrolasi.
Nel presente studio, pareti cellulari frumento endosperma de-inamidata stati isolati come un residuo di alcool insolubili (AIR) e sequenzialmente estratta con acqua (W-sol Fr) e KOH 1M contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto in Ratnayake et al. (2014) 2. Gli oligosaccaridi rilasciate sia da W- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata sia dei nativi oligosaccaridi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-accoppiato con HPLC con il separazione cromatografica online utilizzando un C-18 colonna RPe ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito KOH-sol AX è stato caratterizzato anche da risonanza magnetica nucleare (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
La maggior parte dei polisaccaridi della parete cellulare Phase Matrix hanno dorsali apparentemente sostituito in modo casuale (sia con glycosyl e residui non glicosil) che sono molto variabili a seconda delle specie di piante, stadio di sviluppo e tipo di tessuto 3. Poiché polisaccaridi sono prodotti genici secondari loro sequenza non è modello derivato e pertanto non vi è un unico approccio analitico, come esiste per acidi nucleici e proteine, per la loro sequenza. La disponibilità di purificati enzimi …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
Riferimenti
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