La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos. Paredes celulares del endospermo de trigo De almidonadas-se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) 1 y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe por Ratnayake et al. (2014) 2. Se adoptaron dos enfoques diferentes (véase el resumen en la Figura 1). En el primero, intactos AXs W-sol se tratan con 2AB para etiquetar el RE columna vertebral residuo original de azúcar de cadena y luego tratados con una endoxilanasa para generar una mezcla de RE 2AB marcado y la región interna reducir oligosacáridos, respectivamente. En un segundo enfoque, el Fr KOH-sol se hidroliza con endoxilanasa para generar primero una mezcla de oligosacáridos que posteriormente se etiquetan con 2AB. Los liberados enzimáticamente (ONU) (etiquetados) oligosacáridos de ambosW- y los PP KOH-sol son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizan por resonancia magnética nuclear (RMN), que también proporciona información sobre la configuración anomérica. Estas técnicas se pueden aplicar a otras clases de polisacáridos utilizando las endo-hidrolasas adecuadas.
Introduction
Heteroxilanos son una familia de polisacáridos que son los polisacáridos no celulósicos predominantes de las paredes primarias de gramíneas y las paredes secundarias de todas las angiospermas 3-6. Las cadenas principales de xilano difieren en sus tipos y patrones de sustitución con glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinosa (Araf)) y los residuos en función del tipo de tejido, el grado de desarrollo y las especies no-glicosil 7 (O-acetilo, ácido ferúlico).
Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endospermo se componen principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) y (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanos (20%) con cantidades menores de celulosa y heteromannans (2% cada uno) 8. La cadena principal de xilano puede ser diversamente un-sustituido y predominantemente mono-sustituido (principalmente O-2 posición y en menor medida O-3 posición) y (O-2 y O-3 posiciones) con α-L-Ara di-sustituido residuos de F 9. El extremo reductor (RE) de heteroxilanos de dicotiledóneas (por ejemplo, de Arabidopsis thaliana) 10 y gimnospermas (por ejemplo, el abeto (Picea abies)) 11 contiene una secuencia característica tetrasacárido glicosilo; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Para entender la biosíntesis y la función (biológica y industrial) heteroxilano, es importante para secuenciar completamente la columna vertebral de xilano entender los tipos y los patrones de sustituciones, así como la secuencia del extremo reductor (RE).
Las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos se describen en este manuscrito. Las técnicas se basan en el etiquetado de fluoróforo (con 2 aminobenzamida (2AB)) el extremo reductor (RE) de la cadena heteroxilano antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa). Este enfoque, en particular para la secuenciación RE, eraprimero reportada por el laboratorio York 10,12-13 pero ahora se extiende para incluir la secuenciación región interna y es una combinación de las técnicas establecidas que es igualmente adaptable a todos los heteroxilanos independientemente de su fuente de aislamiento. Este enfoque también se puede aplicar a otras clases de polisacáridos usando (si está disponible) las endo-hidrolasas adecuadas.
En el presente estudio, las paredes de-almidonado celulares del endospermo de trigo se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe en Ratnayake et al. (2014) 2. Los oligosacáridos liberados tanto de Frs KOH-sol W- y son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-acoplado con HPLC con el separación cromatográfica en línea usando una columna RP C-18y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizó por resonancia magnética nuclear (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayoría de los polisacáridos de la pared celular de la fase de matriz han backbones aparentemente sustituido al azar (con tanto glicosilo y residuos no glicosilo) que son muy variable dependiendo de las especies de plantas, el grado de desarrollo y tipo de tejido 3. Desde polisacáridos son productos de los genes secundarios su secuencia no es plantilla derivada y por lo tanto no hay un enfoque analítico único, como el que existe para los ácidos nucleicos y proteínas, para su secuenciación. La dispo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
Riferimenti
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