एकल न्यूक्लियस स्तर पर लाइन -1 Retrotransposition का विश्लेषण

Summary

यहाँ हम HepG2 सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक सिंथेटिक लाइन -1 व्यक्त करने का गुणसूत्र फैलता में एकल नाभिक स्तर पर लाइन -1 retrotransposition ट्रैक करने के लिए मछली कार्यप्रणाली को रोजगार।

Abstract

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Introduction

मानव लांग बीच-बीच परमाणु तत्व-1 (लाइन -1 या एल 1) एक स्वायत्त मोबाइल तत्व है कि एक के माध्यम से जीनोम के भीतर प्रसारित "कॉपी और पेस्ट" retrotransposition तंत्र है। एक ठेठ मानव एल 1 ~ 6 KB लंबा है और एक 5'UTR (untranslated क्षेत्र) है कि एक प्रवर्तक के रूप में कार्य करता है के होते हैं, दो खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs): एल 1 और एल 1 -ORF1 -ORF2, और एक Pólya के साथ एक 3'UTR । एक तार-तार डोमेन, आरएनए मान्यता आकृति और सी टर्मिनल डोमेन, जबकि एल 1 -ORF2 प्रोटीन endonuclease है, ट्रांसक्रिप्टेज और सिस्टीन अमीर डोमेन ^1,2,3,4,5 रिवर्स: एल 1 पूंछ -ORF1 प्रोटीन तीन अलग डोमेन है। एल 1 -ORF1 न्यूक्लिक एसिड निगरानी गतिविधियों को दर्शाती है, जबकि एल 1 -ORF2, enzymatic गतिविधियों प्रदान करता है retrotransposition ^1,2,6 के लिए आवश्यक दोनों प्रोटीन के साथ।

एल 1 retrotransposition का एक चक्र एल 1 के 5'UTR से प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है </उन्हें> शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, translocation कोशिका द्रव्य में, और अनुवाद के द्वारा bicistronic mRNA। कोशिका द्रव्य में, एल 1 -ORF1 दर्शाती है या तो सीआईएस -binding जहां यह अपने आप ही आरएनए संकुल या ट्रांस -binding जहां यह अन्य RNAs पैकेज (यानी, साइन / SVAs / pseudogenes) एल 1 -ORF2p ^{7 के} साथ एक ribonucleoprotein कण (RNP) के रूप ^{में, 8।} RNPs नाभिक जहां एल 1 -ORF2p Nicks जीनोमिक डीएनए (gDNA) के endonuclease गतिविधि एक ओह को बेनकाब करने में सरकाना ^– समूह ^9, कि प्रधानमंत्री को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा इस्तेमाल के बदले में है और 3 'के अंत से डीएनए को synthesize आरएनए रिवर्स। रिवर्स संश्लेषण के दौरान, डीएनए का दूसरा किनारा कंपित टूट जाता है जो हस्ताक्षर एल 1 प्रविष्टि दृश्यों (जैसे, TTTTAA) नामक लक्ष्य साइट दोहराव (टीएसडी) ^9,10 के लिए फार्म भर रहे हैं बनाने के लिए मूल निक साइट से 7-20 बीपी nicked है। इस प्रक्रिया के रूप में लक्ष्य प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन (TPRT) में जाना जाता है और inserti की ओर जाता हैTPRT-तरह गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के कुछ कोशिकाओं प्रकार ¹¹ में डाला अनुक्रम के दोनों सिरों पर TSDs साथ एल 1 / अन्य DNAs का पूरा या छोटा प्रतियों की पर। एल 1 retrotransposition भी माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है।

एल 1 retrotransposition हमारे अध्ययन में कार्यरत वेक्टर गैर episomal है और टैग एल 1 -ORF1 और 2p संयुक्त सीएमवी L1-5'UTR प्रमोटरों द्वारा संचालित (चित्रा 1) ¹² के होते हैं। इस निर्माण के पहले के संस्करणों खमीर और मानव सेल संस्कृतियों ^13,14,15 का उपयोग अध्ययन में वर्णित किया गया है। दो अलग सीएमवी 5 'और 3' में स्थित प्रमोटरों, वेक्टर के समाप्त हो जाती है 3 'के अंत के साथ रिवर्स उन्मुखीकरण में रखा splicing और एकीकरण के बाद neomycin की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए। 3 'अंत में retrotransposition सूचक कैसेट एल 1 -ORFs करने के लिए एक neomycin जीन डाला antisense के होते हैं और एक ग्लोब द्वारा दो हिस्सों में जुदाई से निष्क्रिय प्रदान की गई हैspliced ​​दाता (एसडी) और spliced ​​स्वीकर्ता (एसए) साइटों (चित्रा 1) के साथ intron में। एक गुणसूत्र में एकीकरण पर, एल 1 आम प्रमोटर से लिखित है एक mRNA कि एक bicistronic mRNA और निष्क्रिय neomycin mRNA के होते हैं उपज है। आरएनए प्रसंस्करण के दौरान, ग्लोबिन Intron neomycin जीन से बाहर spliced ​​है एक पूरी तरह कार्यात्मक neomycin जीन बहाल करने के लिए। संकर mRNA सीआईएस में एक RNP में पैक और नाभिक जहां यह TPRT का उपयोग कर सकते हैं या तो पूरी लंबाई या छोटा सम्मिलन के रूप में जीनोम में एकीकृत है में translocated है।

यहाँ हम एक पद्धति स्वस्थानी संकरण (मछली) जांच विशेष रूप से spliced ​​neomycin जीन (SNeo) के निर्देश पर साथ में प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है कि एक नाभिक स्तर पर एल 1 -retrotransposiition पैटर्न और सम्मिलन दरों को ट्रैक करने का वर्णन है। दक्षता और पता लगाने की विशिष्टता det को retrotransposition सक्षम और अक्षम निर्माणों और जांच का उपयोग कर पुष्टि की गईect SNeo या neomycin और Intron जंक्शन ¹⁶ ग्लोबिन। इस पद्धति में इस तरह के कई सम्मिलन, कॉलोनी प्रतिरोध और अनुकूल क्लोन विस्तार के रूप में सेल संस्कृति आधारित retrotransposition assays, की कमियों का एक कारण है।

Protocol

नोट: सभी चरणों के कमरे के तापमान पर बाहर किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट। कैसे व्यक्तिगत अभिकर्मकों तैयार करने पर जानकारी के लिए अभिकर्मकों अनुभाग को देखें। 1. लेबल एल 1 जांच <p class="jove_…

Representative Results

एल 1 retrotransposition वेक्टर के एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। वेक्टर एल 1 ORFs को antisense अभिविन्यास में एक neomycin जीन है कि भावना अभिविन्यास में एक ग्लोबिन Intron से बाधित और द्वारा एस…

Discussion

इस तरह पूरे जीनोम अनुक्रमण, उलटा पीसीआर और दक्षिणी सोख्ता के रूप में के तरीके में एल 1 retrotransposition अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि इन तरीकों का पता लगाने के लिए जहां एल 1 सम्मिलन जीनोम क?…

Materials

Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10X colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM  in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparing chromosome Spreads.
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media  to a final concentration of 0.4 µg/mL
1M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1mg/mL of Rnase A			Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve  pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses.  Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.  Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount
Detection Buffer			Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.