علاج الفئران SCA1 مع للذوبان في الماء المركبات لغير وجه التحديد زيادة وظيفة الميتوكوندريا
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا هاما في عملية الشيخوخة والأمراض العصبية بما في ذلك عدة الرنح النخاعي المخيخي وراثية وغيرها من اضطرابات الحركة تميزت الضمور التدريجي من المخيخ. والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم ضعف الميتوكوندريا في مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) وتقييم فعالية استهداف الدوائية التنفس الأيض عن طريق مركب حمض السكسينيك للذوبان في الماء لإبطاء تطور المرض. هذا النهج هو الذي ينطبق على أمراض المخيخ الأخرى، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة من العلاجات للذوبان في الماء.
يستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لكشف وتحديد التغيرات المرتبطة المرض في وظيفة الميتوكوندريا. مع الدليل الجيني الوراثي (بيانات غير منشورة) والأدلة البروتين من ضعف الميتوكوندريا في نموذج SCA1 الماوس، نحن تقييم فعالية العلاج مع ذوبان في الماء الأيض الداعم الصورةحمض uccinic عن طريق إذابة هذا المركب مباشرة في مياه الشرب المنزلية القفص. قدرة المخدرات لتمرير حاجز الدم في الدماغ يمكن استخلاصه باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). فعالية هذه المركبات يمكن أن يكون من الممكن اختبارها باستخدام نماذج سلوكية متعددة بما في ذلك rotarod تسريع والتوازن اختبار شعاع وتحليل البصمة. سلامة Cytoarchitectural من المخيخ يمكن تقييم باستخدام المقايسات المناعي التي تكشف عن نوى الخلايا العصبية والتشعبات الخلية العصبية وسوما. وهذه الأساليب هي أساليب قوية لتحديد الخلل الميتوكوندريا وفعالية العلاج مع مركبات قابلة للذوبان في الماء في أمراض الاعصاب المخيخ.
Introduction
الميتوكوندريا هي المنتجين الرئيسيين للالأدينوساين ثلاثي (ATP)، وهو أنزيم أساسي للطاقة الخلوية، مع غالبية ATP الميتوكوندريا تنتج من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) باستخدام سلسلة نقل الإلكترون. الدماغ، نظرا لمطالب الأيض عالية واعتمادها على الفسفرة التأكسدية لتوفير الطاقة النشاط العصبي، هو عرضة للضعف الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، يتم تشغيل ضعف الميتوكوندريا أثناء عملية الشيخوخة 1 والمتورطين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية 2، 3، 4. وبالتالي، فإنه يترتب على ذلك أن الميتوكوندريا هي الأهداف العلاجية جذابة للالتنكس العصبي.
في هذا البروتوكول، الذي اعتمدناه استخدام مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) بأنه مرض الاعصاب نموذجي لدراسة الميتوكوندرياضعف لتر وتطوير علاجات تستهدف الميتوكوندريا. ويتسبب SCA1 عن طفرة polyglutamine (polyQ) تكرار التوسع في الجين المنتج ataxin-1 الذي يؤدي التنكس التدريجي للخلايا العصبية العصبية في المخيخ والخلايا العصبية من مناطق أخرى من الدماغ. خط المعدلة وراثيا الماوس المستخدمة هنا (تسمى الماوس SCA1)، الذي يعبر عن ataxin-1 التحوير-polyQ متحولة تحت سيطرة أحد المروجين محددة العصبية خلية، يسمح لتحليل المستهدفة من عنصر العصبية خلية من SCA1 5. الفئران SCA1 تخضع تدريجيا انحطاط الخلايا العصبية وتطوير مشية اانتظامية 6.
اختلال وظيفي معقد الميتوكوندريا والتي تستهدف الميتوكوندريا العلاج فعالية يمكن تقييمها مع بطارية من المقايسات الجزيئية والسلوكية. يتم قياس الخلل معقدة الميتوكوندريا خارج الجسم الحي بواسطة فحوصات التنفس التي تكشف عن استهلاك الأوكسجين تغير في أنسجة دماغ في حالةوجود ركائز سلسلة نقل الإلكترون ومثبطات 7. سبق استخدامها فحوصات التنفس مع الأنسجة permeabilized، العزلات الميتوكوندريا، والنسيج كله 7 و 8 و 9. أنها تسمح للتقييم المباشر وظيفة الميتوكوندريا على عكس طرق جمع البيانات المورفولوجية مثل المجهر الإلكتروني النافذ أو تلطيخ المناعي. استخدام النسيج كله بدلا من الميتوكوندريا معزولة يمنع اختيار منحازة الميتوكوندريا الصحية التي قد تحدث أثناء عملية عزل 7. عندما تكييفها وفقا لبروتوكول كما هو موضح، وفحص التنفس هو طريقة قيمة للكشف عن ضعف الميتوكوندريا في الحالات المرضية العصبية للدماغ.
المنشطات غير محددة من عملية التمثيل الغذائي يمكن أن تستخدم للاستدلال ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الامراض العصبيةه والمساعدة في تطوير علاجات جديدة. كلها قد أظهرت كيرسيتين، أنزيم Q10 والكرياتين لتحسين علم الأمراض العصبية التنكسية في المرضى وفي النماذج الحيوانية من مرض الاعصاب 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. هنا نقدم منشط الأيض الرواية، وحمض السكسينيك، لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية. للتأكد من أن المنشط هو عبور حاجز الدم في الدماغ، كان يعمل HPLC للكشف عن تسليمها إلى الأنسجة العصبية في الفئران التي عولجت 17.
لتقييم الآثار العلاجية من المياه المستهدفة عملية الأيض المركبات القابلة للذوبان مثل حمض السكسينيك، وبطارية من النماذج السلوكية والدراسات immunopathological يمكن استخدامها. دووتستخدم البريد إلى عجز في التنسيق الحركي وجدت في أمراض المخيخ الاعصاب، البصمة المدرج الفحص، شعاع الفحص وتسريع الدورية فحص قضيب للكشف عن إنقاذ علم الأمراض السلوكية 6 و 18 و 19. وتستكمل هذه الإجراءات مع تقييم immunopathological من التهندس الخلوي للدماغ من خلال تقييم سمك طبقة الجزيئية (كما هو موضح العصبية خلية شجيري طول الشجرة) والعصبية تعداد خلايا سوما ضمن فصيص محددة من الأنسجة المخيخ 6 و 20 و 21. هنا نقدم عدة طرق عصبية مرضية والسلوكية للكشف وعلاج ضعف الميتوكوندريا مع المركبات القابلة للذوبان المياه المستهدفة عملية الأيض.
نحن نستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لتحليل ضعف الميتوكوندريا في تران SCA1الماوس sgenic. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن أعراض المرض وعلم الأمراض وتحسن من الميتوكوندريا حمض معززة السكسينيك للذوبان في الماء، مما يزيد من تورط ضعف الميتوكوندريا في تطور المرض SCA1.
Protocol
Representative Results
Discussion
إذا تم استخدام هذه الأساليب كما هو موضح، فهي قادرة على اكتشاف وتخفيف التأكسدي بوساطة الفسفرة ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران مرض الاعصاب المخيخ. فحوصات الكيمياء الحيوية والسلوكية المشتركة هي طرق متعددة الأوجه لتحديد مدى مساهمة الميتوكوندريا إلى المخيخ علم الأم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
