Behandling SCA1 Mus med vandopløselige forbindelser til uspecifikt Boost mitokondriefunktionen
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitokondriel dysfunktion spiller en væsentlig rolle i aldringsprocessen og i neurodegenerative sygdomme, herunder flere arvelige spinocerebellar ataksi og andre bevægelsesforstyrrelser præget af progressiv degeneration af lillehjernen. Målet med denne protokol er at vurdere mitokondrielle dysfunktioner i Spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) og vurdere effekten af farmakologiske målretning af metabolisk respiration via vandopløselig forbindelse ravsyre til at bremse sygdommens progression. Denne fremgangsmåde kan anvendes til andre cerebellare sygdomme og kan tilpasses med en masse vandopløselige terapier.
Ex vivo-analyse af mitokondriel respiration anvendes til påvisning og kvantificering sygdomsrelaterede ændringer i mitokondrisk funktion. Med genetisk beviser (upublicerede data) og proteomisk dokumentation for mitokondriel dysfunktion i SCA1 musemodel, vi evaluere effekten af behandlingen med det vandopløselige metaboliske booster succinic syre ved opløsning af denne forbindelse direkte ind i hjemmet bur drikkevand. Evnen af medikamentet til at passere blod-hjerne-barrieren kan udledes ved anvendelse af højtydende væskekromatografi (HPLC). Effekten af disse forbindelser kan derefter testes ved hjælp af flere adfærdsmæssige paradigmer herunder den accelererende roterende stav, balance beam test og footprint-analyse. Cytoarchitectural integritet cerebellum kan vurderes ved anvendelse immunofluorescensassays der registrerer Purkinje cellekerner og purkinjecelle dendritter og soma. Disse metoder er robuste teknikker til bestemmelse mitokondriel dysfunktion og effekten af behandling med vandopløselige forbindelser i cerebellær neurodegenerativ sygdom.
Introduction
Mitokondrier er de vigtigste producenter af adenosintriphosphat (ATP), et essentielt coenzym for cellulær energi, med de fleste af mitokondrie ATP produceres ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS) under anvendelse elektrontransportkæden. Hjernen, på grund af dens høje metaboliske krav og dens afhængighed af oxidativ phosphorylering til strømforsyning neurale aktivitet, er meget modtagelige for mitochondrial dysfunktion. Som følge heraf er mitokondriel dysfunktion udløses under modningen 1 og er impliceret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme 2, 3, 4. Derfor følger det, at mitokondrier er attraktive terapeutiske mål for neurodegeneration.
I denne protokol, har vi vedtaget at anvende Spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) som model neurodegenerativ sygdom for studiet af mitokondrierl dysfunktion og udvikling af mitokondrie-målrettede behandlinger. SCA1 er forårsaget af en polyglutamine (polyQ) repeat ekspansion mutation i ataxin-1-genproduktet, der udløser progressiv degeneration af Purkinje-neuroner i cerebellum og neuroner fra andre hjerneområder. Den transgene mus anvendes her line (betegnet som SCA1 mus), der udtrykker et polyQ-mutant ataxin-1-transgen under kontrol af en Purkinje-cellespecifik promotor, muliggør målrettet analyse af Purkinje-celle komponent SCA1 5. SCA1 mus undergår gradvis purkinjecelle degeneration og udvikle ataxiske gangart 6.
Mitokondriel kompleks dysfunktion og mitokondrie-målrettet behandling effektivitet kan evalueres med et batteri af molekylære og adfærdsmæssige analyser. Mitokondriel kompleks dysfunktion måles ex vivo ved respiration assays, der registrerer ændret oxygenforbrug inden cerebellare væv itilstedeværelsen af elektrontransportkæden substrater og inhibitorer 7. Respiration assays er tidligere blevet anvendt med permeabiliserede væv, mitokondrielle isolater, og hele væv 7, 8, 9. De gør det muligt for direkte vurdering af mitokondriefunktionen modsætning morfologiske dataindsamlingsmetoder såsom transmission elektronmikroskopi eller immunfluorescensfarvning. Brugen af hele væv snarere end isolerede mitokondrier forhindrer forudindtaget udvalg af sunde mitochondrier, der kan opstå i løbet af isolation proces 7. , Tilpasset protokol som vist, respiration assayet er en værdifuld metode til detektion mitokondriel dysfunktion i cerebellare neurodegenerative sygdomstilstande.
Ikke-specifikke aktivatorer af metabolisme kan anvendes til at udlede mitokondriel dysfunktion i transgene musemodeller af neurodegenerative disease og støtte i udviklingen af nye terapier. Quercetin, coenzym Q10 og kreatin har alle vist sig at lindre neurodegenerativ sygdom patologi hos patienter og i dyremodeller af neurodegenerativ sygdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Her præsenterer vi en hidtil ukendt metabolisk aktivator, ravsyre, stimulere stofskiftet og øge mitokondriefunktion i neurodegenerativ sygdom. For at sikre, at aktivatoren krydser blodhjernebarrieren, blev HPLC anvendt til at påvise levering til neuralt væv i behandlede mus 17.
For at evaluere de terapeutiske virkninger af metabolisk målrettet vandopløselige forbindelser, såsom ravsyre, kan anvendes et batteri af adfærdsmæssige paradigmer og immunopatologiske undersøgelser. duE den motoriske mangler på cerebellar neurodegenerativ sygdom, fodaftryk landingsbanen assay stråle assay og accelererende roterende stang-assay anvendes til at opdage redning af adfærdsmæssig patologi 6, 18, 19. Disse foranstaltninger suppleres med immunpatologisk vurdering af cerebellare cytoarchitecture ved at vurdere molekylær lagtykkelse (defineret som purkinjecelle dendritiske lysthus længde) og purkinjecelle soma tæller inden for et afgrænset lobule af cerebellar væv 6, 20, 21. Her præsenterer vi flere neuropatologiske og adfærdsmæssige metoder til påvisning og behandling af mitokondriel dysfunktion med metabolisk målrettet vandopløselige forbindelser.
Vi bruger ex vivo analyse af mitokondriel respiration til at analysere mitokondriel dysfunktion i SCA1 transgenic mus. Endvidere viser vi, at sygdomssymptomer og patologi forbedres ved den vandopløselige mitokondrie booster ravsyre, yderligere implicerer mitokondriel dysfunktion i SCA1 sygdomsprogression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hvis der anvendes disse metoder som beskrevet, de er i stand til at detektere og afhjælpe oxidativ phosphorylering-medieret mitokondriel dysfunktion i cerebellare neurodegenerative sygdom musemodeller. De kombinerede biokemiske og adfærdsmæssige analyser er mangesidede metoder til bestemmelse af omfanget af mitokondrie bidrag til cerebellare neurodegenerativ sygdom patologi. Ved at behandle mus med ravsyre at stimulere stofskiftet og øge mitokondriefunktionen, er vi i stand til at vise en redning af cerebellare adf?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
