Presentiamo un protocollo biochimico e comportamentale per valutare l'efficacia dei composti idrosolubili mirati ai mitocondri per il trattamento dell'atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) e di altre malattie neurodegenerative cerebellari.
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Articolo metodologico
Trattare Topi SCA1 con solubile in acqua composti non-specifico Boost mitocondriale Funzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La disfunzione mitocondriale svolge un ruolo significativo nel processo di invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative tra cui diversi atassie ereditarie spinocerebellari e di altri disturbi del movimento segnato da una progressiva degenerazione del cervelletto. L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la disfunzione mitocondriale in atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) e valutare l'efficacia del targeting farmacologica della respirazione metabolica attraverso l'acido succinico composto idrosolubile per rallentare la progressione della malattia. Questo approccio è applicabile ad altre malattie cerebellari e può essere adattato ad una serie di terapie idrosolubili.
Ex vivo l'analisi della respirazione mitocondriale viene utilizzata per rilevare e quantificare i cambiamenti correlati alla malattia in funzione mitocondriale. Con prove genetiche (dati non pubblicati) e la prova proteomica di disfunzione mitocondriale nel modello SCA1 del mouse, si valuta l'efficacia del trattamento con l'solubile in acqua metabolica richiamo sL'acido uccinic sciogliendo questo composto direttamente in acqua potabile gabbia casa. La capacità del farmaco di passare la barriera emato-encefalica può essere dedotta mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L'efficacia di questi composti può quindi essere testato l'utilizzo di più paradigmi comportamentali tra cui il rotarod accelerazione, prova trave e analisi impronta. integrità Cytoarchitectural del cervelletto può essere valutata mediante saggi di immunofluorescenza che rilevano nuclei delle cellule di Purkinje e dendriti delle cellule di Purkinje e soma. Questi metodi sono tecniche robuste per determinare la disfunzione mitocondriale e l'efficacia del trattamento con composti solubili in acqua in malattia neurodegenerativa cerebellare.
Introduzione
I mitocondri sono i principali produttori di adenosina trifosfato (ATP), un coenzima essenziale per energia cellulare, con la maggioranza di ATP mitocondriale prodotto mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS) utilizzando la catena di trasporto degli elettroni. Il cervello, dato le sue alte richieste metaboliche e la sua dipendenza da fosforilazione ossidativa per alimentare l'attività neurale, è altamente sensibile alla disfunzione mitocondriale. Come risultato, disfunzione mitocondriale viene attivato durante il processo di invecchiamento 1 ed è implicato nella patogenesi di molteplici patologie neurodegenerative
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida IACUC a Skidmore College di per lavorare con i topi.
1. Il trattamento con composti idrosolubili
- Sciogliere acido succinico ad una concentrazione di 0,75 mg / ml in acqua cage potabile. Si noti che qualsiasi composto idrosolubile di interesse alla concentrazione desiderata potrebbe essere sostituito in questa fase. Mescolare soluzione per assicurarsi che il composto sia completamente dissolto.
- Dopo topi raggiungono l'età desiderata del trattamento, sostituire l'acqua potabile gabbia a casa della condizione gruppo di trattamento con la soluzione al passo 1.1.
- Misurare il peso di entr....
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Risultati
Attraverso il targeting farmacologico dei mitocondri cerebellare con acido succinico siamo in grado di prevenire la disfunzione mitocondriale in un modello murino della cerebellare SCA1 malattia neurodegenerativa. Il donatore di elettroni canonica di succinato deidrogenasi, acido succinico, è stato sciolto in acqua potabile gabbia casa di topi SCA1 per un mese, con inizio comportamentale valutazione durante la seconda settimana di trattamento e di valutazione neuropatologico dopo il trat.......
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Discussione
Se si utilizzano questi metodi come descritto, sono in grado di rilevare e alleviare ossidativa disfunzione mitocondriale fosforilazione mediata in modelli murini malattie neurodegenerative cerebellari. I saggi biochimici e comportamentali combinate sono metodi poliedrici per determinare l'entità del contributo mitocondriale per cerebellare patologia malattia neurodegenerativa. Trattando i topi con l'acido succinico per stimolare il metabolismo e aumentare la funzione mitocondriale, siamo in grado di mostrare un.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Harry Orr dell'Università del Minnesota per il suo generoso dono di topi transgenici. Vorremmo anche ringraziare i seguenti alunni dello Skidmore College per il loro lavoro nell'esecuzione degli esperimenti precedenti: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson e Cheyanne Slocum. Inoltre, vorremmo ringraziare lo Skidmore College per aver finanziato lo sviluppo di questi metodi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenosina difosfato | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbato | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindolo | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonina | Sigma Aldrich | D141 | |
| Ditiotreitolo | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Siero d'asino | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutammato | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malato | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitolo | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassio-lattobionato | Bio-zuccheri | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Acido succinico | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′ -Tetrametil-p-fenilendiammina | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mezzo di montaggio | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ anticorpo (anti-atassina-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anticorpo secondario anti-topo | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anticorpo secondario anti-coniglio | Life Technologies | A-11012 | |
| Anticorpo Calbindin (capra) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Controllo dei topi transgenici | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| topi SCA1 | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Topi wildtype | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L Microtomo | ERMA | Sledge Microscopio | |
| confocale Fluoview FV1200 | Olympus | ||
| Glicerolo-gelatina vetrini | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Siringa Hamilton | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Unità di controllo dell'elettrodo Oxytherm | Hansatech Instruments | ||
| Carta P.T.F.E. | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP& G | contattare l'autore corrispondente per informazioni | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P& G Rota-Rod v3.3.3 (software rotarod) | PPP& G | contattare l'autore corrispondente per informazioni | |
| Phidget21.dll (necessario per il software rotarod) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A.
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Ristampe e permessi
