Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitochondriale Dysfunktion spielt eine bedeutende Rolle im Alterungsprozess und bei neurodegenerativen Erkrankungen, darunter mehrere erbliche Spinozerebelläre Ataxie und andere Bewegung durch eine progressive Degeneration des Kleinhirns markierten Störungen. Das Ziel dieses Protokolls ist mitochondriale Dysfunktion in spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) und Bewertung der Wirksamkeit von pharmakologischen Targeting von Stoffwechselatmung über die wasserlösliche Verbindung Bernsteinsäure zu beurteilen, Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen. Dieser Ansatz ist auf andere cerebellar Krankheiten und kann zu einer Vielzahl von wasserlöslichen Therapien angepasst werden.
Ex – vivo – Analyse der mitochondrialen Atmung wird verwendet , um zu erkennen und krankheitsbedingte Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien zu quantifizieren. Mit genetischen Beweis (nicht veröffentlichte Daten) und Proteomik Beweise für mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 Mausmodell bewerten wir die Wirksamkeit der Behandlung mit dem wasserlöslichen metabolischen Booster succinic Säure durch diese Verbindung direkt in den Käfig Trinkwasser auflösen. Die Fähigkeit des Medikaments, die Blut-Hirn-Schranke passieren kann mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) abgeleitet werden. Die Wirksamkeit dieser Verbindungen können dann mehrere Verhaltensparadigmen einschließlich der Beschleunigungs Rotarod, Schwebebalken Test und Fußabdruck-Analyse unter Verwendung getestet werden. Cytoarchitectural Integrität des Kleinhirns kann mit Immunfluoreszenztests bewertet werden, die Purkinje Zellkerne und Purkinje Zelle Dendriten und soma erkennen. Diese Verfahren sind robust Techniken zur Bestimmung mitochondriale Dysfunktion und die Wirksamkeit der Behandlung mit wasserlöslichen Verbindungen in cerebellar neurodegenerative Erkrankung.
Introduction
Mitochondrien sind die wichtigsten Produzenten von Adenosintriphosphat (ATP), ein essentielles Coenzym für die Zellenergie, mit der Mehrheit der mitochondrialen ATP durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt die Elektronentransportkette verwendet wird. Das Gehirn, angesichts der hohen metabolischen Anforderungen und sein Vertrauen auf die oxidative Phosphorylierung für neuronale Aktivität antreibt, ist auf mitochondriale Dysfunktion sehr anfällig. Als Ergebnis wird die mitochondriale Funktionsstörung während des Alterungsprozesses ausgelöst 1 und ist in die Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen 2, 3, 4 gebracht. Daraus folgt, dass Mitochondrien attraktive therapeutische Ziele für die Neurodegeneration sind.
In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) als Modell neurodegenerative Erkrankung zur Untersuchung von Mitochondrien angenommenenl Dysfunktion und die Entwicklung der Mitochondrien zielgerichtete Therapien. SCA1 wird durch eine Polyglutamin (polyQ) Repeat – Expansion Mutation im Ataxin-1 – Genprodukts verursacht , die progressive Degeneration der Purkinje – Neuronen des Kleinhirns löst und Neuronen aus anderen Hirnregionen. Die transgene Mauslinie hier (bezeichnet als SCA1 Maus) verwendet, die eine polyQ-Mutante unter der Kontrolle einer Purkinje-Zelle spezifischer Promotor Ataxin-1 – Transgen exprimiert, ermöglicht die gezielte Analyse der Purkinje-Zellkomponente von SCA1 5. SCA1 Mäuse unterziehen allmähliche Purkinje Zelldegeneration und entwickeln ataxic Gangart 6.
Mitochondriale komplexe Dysfunktion und mitochondriale gezielte Wirksamkeit der Behandlung kann mit einer Batterie von molekularen und Verhaltenstests bewertet werden. Mitochondriale komplexe Dysfunktion gemessen ex vivo durch die Atmung Assays , die veränderte Sauerstoffverbrauch innerhalb des Kleinhirns Gewebe erkennen indas Vorhandensein von Elektronentransportkette Substrate und Inhibitoren 7. Respiration Assays mit permeabilisierten Gewebe, mitochondriale Isolate und ganze Gewebe 7, 8, 9 verwendete vorher. Sie ermöglichen eine direkte Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Gegensatz zu morphologischen Methoden der Datenerhebung wie Transmissionselektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenzanfärbung. Die Verwendung von ganzen Gewebe anstatt isolierten Mitochondrien verhindert vorgespannte Auswahl an gesunden Mitochondrien , die 7 während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Wenn das Protokoll angepasst, wie dargestellt, ist die Atmungs Assay eine wertvolle Methode für mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheitszustände zu detektieren.
Die nicht-spezifische Aktivatoren des Stoffwechsels verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion in transgenen Mäusen Modellen neurodegenerativer diseas ableitene und die Hilfe bei der Entwicklung neuer Therapien. Quercetin, Coenzym Q10 und Kreatin wurden alle neurodegenerative Krankheitspathologie in Patienten und in Tiermodellen für neurodegenerative Krankheits 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 verbessern gezeigt. Hier stellen wir eine neue Stoffwechselaktivator, Bernsteinsäure, den Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondrien bei neurodegenerativen Erkrankung steigern. Um sicherzustellen , dass der Aktivator die Blut – Hirn – Schranke überquert, wurde HPLC verwendet Lieferung an Nervengewebe zu erkennen , in behandelten Mäusen 17.
Um die therapeutischen Wirkungen von metabolisch gezielte wasserlösliche Verbindungen, wie Bernsteinsäure, eine Batterie von Verhaltensparadigmen und immunpathologische Studien bewerten können verwendet werden. Due zu den in Kleinhirns neurodegenerative Erkrankung gefunden Defizite der motorischen Koordination, sind der Ausleuchtzone Runway – Assay, Strahl – Assay und Beschleunigung rotierenden Stab – Test verwendet 6 Rettung von Verhaltens Pathologie zu erkennen, 18, 19. Diese Maßnahmen sind mit immunopathologischen Beurteilung cerebellar Zytoarchitektur ergänzt durch molekulare Schichtdicke (definiert als Purkinje Zelle dendritischen Dorn Länge) Beurteilung und Purkinje Zellsoma Zählwerte innerhalb eines definierten lobule von zerebellären Gewebe 6, 20, 21. Hier präsentieren wir mehrere neuropathologischen und Verhaltens Methoden zur Erkennung und Behandlung von mitochondriale Dysfunktion mit metabolisch gezielt wasserlösliche Verbindungen.
Wir verwenden ex vivo Analyse der mitochondrialen Atmung mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 tran zu analysierensgenic Maus. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Krankheitssymptome und Pathologie durch die wasserlöslichen mitochondrialen Booster Bernsteinsäure verbessert werden, weitere mitochondriale Dysfunktion in SCA1 Krankheitsprogression Verwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wenn diese Methoden verwendet werden, wie beschrieben, sind sie in der Lage zu erkennen und Linderung oxidative Phosphorylierung vermittelte mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheit Mäuse-Modellen. Die vereinigten biochemischen und Verhaltenstests sind vielfältig Methoden für das Ausmaß der mitochondrialen Beitrag zur cerebellar neurodegenerative Krankheitspathologie bestimmen. Durch die Mäuse mit Bernsteinsäure Behandlung von Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
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