Лечение СЦА1 мышей с водорастворимых соединений для неспецифического увеличения митохондриальной функции
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Митохондриальная дисфункция играет важную роль в процессе старения и при нейродегенеративных заболеваниях, включая несколько наследственных спиноцеребеллярные атаксии и других двигательных расстройств, отмеченных прогрессирующей дегенерацией мозжечка. Целью данного протокола является оценка митохондриальную дисфункцию в спиноцеребеллярная типа атаксии 1 (SCA1) и оценки эффективности фармакологической нацеливания метаболического дыхания через растворимое в воде соединение янтарной кислоты, чтобы замедлить прогрессирование заболевания. Этот подход применим и к другим мозжечковых заболеваний и может быть адаптирован к множеству водорастворимых терапии.
Пример естественных условиях анализа митохондриального дыхания используется для выявления и количественной оценки , связанных с болезнью изменений в митохондриальной функции. С помощью генетических данных (неопубликованные данные), а также протеомики доказательства митохондриальной дисфункции в модели СЦА1 мыши, мы оцениваем эффективность лечения с водорастворимым метаболической бустера Succinic кислоты путем растворения этого соединения непосредственно в питьевую воду домой клетке. Способность препарата проходить через гематоэнцефалический барьер может быть выведена с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Эффективность этих соединений могут быть протестированы с использованием нескольких поведенческих парадигм включая ускоряющего rotarod, испытания луча баланса и анализа следа. Cytoarchitectural целостность мозжечка можно оценить с помощью иммунофлуоресцентных анализов, которые обнаруживают клеточные ядра Пуркинье и дендритов клеток Пуркинье и сомы. Эти методы являются надежными методы для определения дисфункцию митохондрий и эффективности лечения водорастворимых соединений в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний.
Introduction
Митохондрии являются ключевыми производителями аденозинтрифосфата (АТФ), которая является основным коферментом для клеточной энергии, с большинством митохондриальной АТФ производится путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) с использованием электронно-транспортной цепи. Мозг, учитывая его высокие метаболические потребности и зависимость от окислительного фосфорилирования для питания нейронной активности, весьма восприимчивы к митохондриальной дисфункции. В результате, митохондриальной дисфункцией срабатывает во время процесса старения 1 и участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний , 2, 3, 4. Таким образом, отсюда следует, что митохондрии являются привлекательными терапевтическими мишенями для нейродегенерации.
В этом протоколе, мы приняли использование спиноцеребеллярная атаксия типа 1 (СЦА1) в качестве модели нейродегенеративных заболеваний для изучения митохондрийл дисфункции и развитие митохондриальных-целенаправленной терапии. СЦА1 вызывается мутацией полиглутаминового (polyQ) расширения повтора в гене продукта атаксина-1 , который вызывает прогрессирующей дегенерацией нейронов Пуркинье в мозжечке и нейроны других областей головного мозга. Трансгенная линия мыши используется здесь (обозначается как СЦА1 мыши), выражающее polyQ-мутант атаксина-1 трансген под контролем специфического Пуркинье-клеточного промотора, позволяет целевого анализа компонента Пуркинье-клеток СЦА1 5. SCA1 мышей подвергаются постепенной дегенерации клеток Пуркинье и развивать атаксическая походку 6.
Митохондриальная дисфункция и комплексная митохондриальным целевой эффективность лечения может быть оценена с батареей молекулярных и поведенческих анализов. Митохондриальная дисфункция комплекс измеряется с помощью экс естественных условиях дыхания анализов , которые обнаруживают измененную потребление кислорода в мозжечковой тканиналичие электронно – транспортной цепи субстратов и ингибиторов 7. Дыхательные анализы ранее использовались с проницаемыми ткани, митохондриальных локализует и цельной ткани 7, 8, 9. Они позволяют прямой оценки митохондриальной функции в отличие от морфологических методов сбора данных, таких как просвечивающей электронной микроскопии или иммунофлуоресцентного окрашивания. Использование всей ткани , а не изолированных митохондриях предотвращает предвзятое выбор здоровых митохондрий , которые могут возникнуть в процессе изоляции 7. Когда приспособлено к протоколу, как показано, анализ дыхания является ценным методом для выявления митохондриальной дисфункции в мозжечке нейродегенеративных болезненных состояний.
Неспецифические активаторы обмена веществ могут быть использованы для вывода дисфункцию митохондрий в моделях трансгенных мышах нейродегенеративных diseasе и помощь в разработке новых методов лечения. Кверцетин, коэнзим Q10 и креатин все было показано , для улучшения нейродегенеративного патологии болезни у больных и у животных моделях нейродегенеративных заболеваний 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Здесь мы представляем новый метаболический активатор, янтарную кислоту, чтобы стимулировать обмен веществ и повысить митохондриальную функцию в нейродегенеративных заболеваний. Для того, чтобы гарантировать , что активатор пересекает гематоэнцефалический барьер, ВЭЖХ использовали для обнаружения доставки в нервной ткани у мышей , обработанных 17.
Для того, чтобы оценить терапевтические эффекты метаболически целевых водорастворимых соединений, таких как янтарная кислота, можно использовать батарею поведенческих парадигм и иммунопатологические исследований. Duе к дефициту координации движений , обнаруженных в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний, анализ ВПП след, анализа луча и ускоряющего вращающегося анализа стержня используются для обнаружения спасение поведенческой патологии 6, 18, 19. Эти меры дополняются иммунопатологической оценки мозжечковой цитоархитектуры путем оценки толщины молекулярного слоя (определяется как Пуркинье клеток дендритных длины оправки) и Пуркинье подсчета клеток Сома в пределах определенного дольки мозжечка ткани 6, 20, 21. Здесь мы представляем несколько нейропатологических и поведенческие методы для выявления и лечения митохондриальной дисфункции с метаболически целевых растворимых в воде соединений.
Мы используем ех естественных условиях анализа митохондриального дыхания для анализа митохондриальной дисфункции в СЦА1 Transgenic мыши. Более того, мы показали, что симптомы болезни и патологии улучшаются водорастворимого митохондриальной бустер янтарной кислоты, далее вовлекая митохондриальную дисфункцию в прогрессии заболевания СЦА1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Если эти методы используются, как описано, они способны обнаруживать и облегчения окислительного фосфорилирования опосредованную дисфункцию митохондрий в мозжечке нейродегенеративных моделях мышей заболевание. Объединенные биохимические и поведенческие тесты являются многообраз…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
