suda çözünür Bileşikleri ile SCA1 Fare tedavisi, spesifik olmayan mitokondriyal fonksiyon Boost
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitokondriyal disfonksiyon yaşlanma sürecinde ve birçok kalıtsal spinoserebellar ataksi ve beyincik ilerleyici dejenerasyonu ile işaretlenmiş diğer hareket bozukluklarının da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokolün amacı, Spinoserebellar ataksi tip 1 (SCA1) mitokondriyal disfonksiyon değerlendirilmesi ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak için suda çözünür bir bileşik süksinik asit yoluyla metabolik solunum farmakolojik hedefleme etkinliğini değerlendirmektir. Bu yaklaşım, diğer serebellar hastalıklar için de geçerlidir ve suda çözülebilen tedavilerin bir konakçıya uyarlanabilir.
Mitokondriyal solunumun ex vivo analiz algılar ve mitokondriyal fonksiyon hastalıkla ilişkili değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Genetik delil (yayınlanmamış veri) ve SCA1 fare modelinde mitokondriyal disfonksiyon proteomik delil ile, suda çözünen metabolik güçlendirici s ile tedavinin etkinliğini değerlendirmekev kafes içme suyu doğrudan bu bileşiği çözülerek uccinic asit elde edildi. kan-beyin bariyerini geçmek ilacın özelliği, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak çıkarılabilir. Bu bileşiklerin etkinliği daha sonra hızlanan totarod, Denge testi ve ayak izi analizi de dahil olmak üzere çok sayıda davranış paradigmalar kullanılarak test edilebilir. Serebellumun Cytoarchitectural bütünlüğü Purkinje hücresi çekirdek ve Purkinje hücresi dendrit ve soma tespit imüno-flüoresan deneyleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntemler, mitokondriyal disfonksiyon ve serebellar nörodejeneratif hastalık suda çözünür bileşikler ile tedavinin etkinliğini belirlemek için güçlü bir tekniktir.
Introduction
Mitokondri elektron taşıma zinciri kullanarak oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile üretilen mitokondriyal ATP çoğunluğu ile, adenozin trifosfat (ATP), hücresel enerji için önemli bir koenzim önemli üreticileridir. Beyin, yüksek metabolik talep ve nöral aktiviteyi güç için oksidatif fosforilasyon olan bağımlılığını göz önüne alındığında, mitokondriyal disfonksiyon son derece hassastır. Bunun bir sonucu olarak, mitokondriyal disfonksiyon yaşlanma sürecinde tetiklenir 1 ve birden fazla nörodejeneratif hastalıklar, 2, 3, 4 patojenezinde rol oynar. Nedenle, mitokondri nörodejenerasyonun için cazip tedavi hedefleri olduğunu izler.
Bu protokol, biz mitokondri çalışmanın bir model nörodejeneratif hastalık olarak Spinoserebellar ataksi tip 1 (SCA1) kullanımını benimsemişl disfonksiyon ve mitokondriyal hedefli tedavilerin geliştirilmesi. SCA1 diğer beyin bölgelerinde Purkinje beyincik nöronların ve nöron ilerleyici dejenerasyonu tetikler ataksin-1 gen ürününde bir poliglutamin (poliQ) tekrar genişleme mutasyonu neden olmaktadır. Bir Purkinje hücresi spesifik promotörünün kontrolü altında bir poliQ mutant ataksin-1 transgeni ifade (SCA-1 fare gibi belirlenen) Burada kullanılan transjenik fare soyu, SCA1 5 Purkinje hücresi bileşeninin hedeflenen analizi sağlar. SCA1 fareler kademeli Purkinje hücre dejenerasyonu geçmesi ve ataksik yürüyüş 6 gelişir.
Mitokondriyal karmaşık disfonksiyon ve mitokondriyal hedefli tedavi etkinliği, moleküler ve davranışsal deneyleri bir pil ile değerlendirilebilir. Mitokondriyal karmaşık disfonksiyon serebellar doku içinde değişmiş oksijen tüketimini tespit solunum tahlilleri ile ex vivo ölçülürelektron taşıma zinciri yüzeyler ve inhibitörleri 7 varlığı. Solunum tahlilleri, daha önce permeabilize doku mitokondriyal izolatlar ve bütün doku 7, 8, 9, kullanılmıştır. Bunlar transmisyon elektron mikroskobu ya immünofloresan boyama gibi morfolojik veri toplama yöntemlerinin aksine mitokondriyal fonksiyonun doğrudan değerlendirilmesi için izin verir. Bütün dokusu yerine izole mitokondri kullanımı izolasyon işlemi 7 sırasında oluşabilecek sağlıklı mitokondri önyargılı seçimini önler. gösterildiği gibi protokole adapte olduğunda, solunum tahlil serebellar nörodejeneratif hastalık durumlarında mitokondriyal disfonksiyon tespit etmek için değerli bir yöntemdir.
metabolizma spesifik olmayan aktivatörler nörodejeneratif hastalığı etkeni transgenik fare modellerinde mitokondriyal disfonksiyon anlaması için kullanılabilirE ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde yardım. Kersetin, koenzim Q10 ve kreatin tüm hastalarda ve nörodejeneratif hastalık 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, hayvan modellerinde nörodejeneratif hastalık patolojisini iyileştirilmesi için gösterilmiştir. Burada metabolizmasını uyaran ve nörodejeneratif hastalıkta mitokondriyal fonksiyonu artırmak için yeni metabolik aktivatörü, süksinik asit, sunuyoruz. Aktivatör, kan-beyin bariyerini geçen olduğundan emin olmak için, HPLC ile tedavi edilmiş farelerde 17 nöral dokuya teslim tespit etmek için kullanılmıştır.
succinic asit ile oluşturulursa metabolik hedeflenen suda çözünür bileşiklerin terapötik etkisini değerlendirmek için, davranış paradigmalar ve immünopatolojik çalışmalar pil kullanılabilmektedir. duserebellar nörodejeneratif hastalık, ayak izi pist deneyi, ışın deneyi ve hızlanan dönen çubuk deneyinde bulunan motor koordinasyon açıkları e davranışsal patoloji 6, 18, 19 kurtarma tespit etmek için kullanılır. Bu önlemler, serebellar doku 6, 20, 21, tanımlı bir lobülün içinde molekül (Purkinje hücresi, dendritik mili uzunluğu olarak tanımlanır) tabaka kalınlığı ve Purkinje hücresi soma sayımları değerlendirerek serebellar hücre mimarisini bir immünopatolojik değerlendirilmesi ile takviye edilmiştir. Burada metabolik hedeflenen suda çözünür bileşikler ile tespiti ve mitokondriyal disfonksiyon tedavisi için çok sayıda nöropatolojik ve davranışsal yöntemler sunuyoruz.
Biz SCA1 tran mitokondriyal disfonksiyon analiz mitokondriyal solunum ex vivo analiz kullanmaksgenic fare. Ayrıca, hastalık semptomları ve patolojisi daha SCA1, hastalığın ilerlemesine mitokondriyal fonksiyon bozukluğu karıştığı, suda çözünür mitokondriyal güçlendirici süksinik asit ile geliştirilmiş olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
tarif edildiği gibi, bu yöntemler kullanılabilir, bunlar tespit ve serebellar nörodejeneratif hastalık fare modellerinde oksidatif fosforilasyon aracılı mitokondriyal fonksiyon bozukluğu hafifletme yeteneğine sahiptir. Kombine biyokimyasal ve davranışsal deneyler serebellar nörodejeneratif hastalık patolojiye mitokondriyal katkının boyutlarını belirlemek için çok yönlü yöntemlerdir. metabolizmayı uyarır ve mitokondriyal fonksiyonunu artırmak için süksinik asit ile fareler tedavi, biz serebella…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Riferimenti
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
