Descriviamo qui un protocollo per isolare le cellule mieloidi dalla pelle di topo e drenare i linfonodi dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti di Plasmodium. La citometria a flusso delle cellule raccolte fornisce un test affidabile per caratterizzare la risposta infiammatoria della pelle e drenante dei linfonodi al parassita.
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Articolo metodologico
Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L'imaging intravitale ha riferito l'assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.
Introduzione
La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all'anno. Infezione da Plasmodium, l'agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all'interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia.
Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In ....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato dell'Istituto Pasteur e dal Comitato Etico locale sulla sperimentazione animale (comitato etico IDF-Paris 1, Paris, France; numero di contratto: 2.012-0.015) ed eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti applicabili.
1. Materiali e reagenti
- Utilizzare femmina Anopheles zanzare stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo la nascita e posteriore come descritto in precedenza 21.
- Utilizzare i parassiti Plasmodium berghei ANKA clone che esprime il gene Green Fluorescent Protein (GFP) sotto il controllo d....
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Risultati
Abbiamo recentemente dimostrato che l'ago-siringa per iniezione di immunizzare dosi di P. berghei sporozoiti nella pelle del mouse induce un reclutamento successiva di neutrofili polimorfonucleati seguite da monociti infiammatorie della pelle e DLN 19. La Sezione protocollo descritto in dettaglio la procedura utilizzata per isolare con successo cellule mieloidi dal vivo da entrambi i tessuti seguenti iniezioni multiple di gran numero di sporozoiti nel derma dell&#.......
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Discussione
Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l'immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea 2.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l'insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l'allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases" (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ketamina: Imalgene® 1.000 | Merial-50 | mg/kg: precedente iniezione di sporozoite 125 mg/kg: sacrificio precedente | |
| Xilazina: Rompun® 2% | Bayer-5 | mg/kg: precedente iniezione di sporozoite 12,5 mg/kg: sacrificio precedente | |
| siringa NanoFil + ago calibro 35 | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Siringa da insulina 0,5 ml/50 U.I. | B. Braun Medical | Piastra per | |
| coltura tissutale 9151125-MultiwellTM a 6 pozzetti... Fondo piatto | BD Falcon | 353046-70 | |
| µ filtro cellulare m | BD Falco | 352350-Siringa | |
| da 2 ml | Terumo | SS-02S-BLUE | |
| MAXTM 15 ml Tubo conico in polipropilene | BD Falcon | 352097-BLUE | |
| MAXTM 50 ml Tubo conico in polipropilene | BD Falcon | 352098-5 | |
| ml di tubo a fondo tondo in polistirene con 35 µ m Tappo Filtro Cellulare | BD Falcon | ||
| 1x CaCl2- e MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094-DMEM | |
| 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021-Collagenasi | |
| da Clostridium histolyticum, Tipo IV 0,5-5,0 unità FALGPA/mg solido | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Desossiribonucleasi I da pancreas bovino, tipo IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 & micro; g/ml |
| di sale disodico EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM o 2,5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500-HEPES | |
| soluzione tampone (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Diluizione 1:10 |
| Anti-topo CD16/CD32 (clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | 10 µ g/ml finale (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grado | Life Technologies | D21490 | 1 µ g/ml finale |
| Anti-topo CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 559864 | Diluizione 1:200 |
| Anti-topo CD11b (clone M1/70) | BD Biosciences | 557657 | Diluizione 1:400 |
| Anti-topo CD8&alfa; (clone 5H10) | Tecnologie per la vita | MCD0830 | Diluizione 1:100 |
| Topi femmina C57BL/6JRj (7 settimane) | Laboratori Janvier | - | - |
Riferimenti
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al.
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