Contrôle optique d'une protéine Neuronal L'utilisation d'un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
Par rapport à la stimulation électrique classique, photostimulation offre une plus grande résolution temporelle et spatiale avec un minimum d'interférences dans le système physiologique de spécimens. Depuis la démonstration de l' utilisation de lasers pour stimuler les neurones en 1971 1, de nombreuses façons créatives ont été inventés pour contrôler l' activité neuronale exogène avec la lumière. Libération optique des agonistes photocaged a longtemps été utilisé pour étudier la réponse physiologique du réseau neuronal à des ligands 2,3,4. Cette technique a limité la spécificité due à la diffusion des agonistes en cage. Spécificité génétique est obtenue en exprimant de manière ectopique canaux opsin sensibles à la lumière et des pompes 5,6,7, et elle a été appliquée avec succès pour moduler des réseaux neuronaux sélectionnés dans des organismes modèles divers. Cependant, il serait difficile d'appliquer cette méthode pour contrôler optiquement diverses autres protéines neuronales, étant donné que le greffage photoresponsiveness à partir des protéines opsin à d'autres protéines would exiger l'ingénierie intense qui peut modifier les caractéristiques naturelles de la protéine à l'étude. Chimiquement attacher un ligand photosensible exogène à une protéine a montré une autre façon de contrôler la fonctionnalité des protéines de canal 8,9,10. Le ligand est présenté ou retiré du site de liaison de la protéine à travers la photoisomérisation du fragment azobenzène. chimie d'attache limite l'application principalement sur le côté extracellulaire de protéines membranaires, à l'exclusion du côté intracellulaire et des protéines intracellulaires.
Photosensibles Uaas, après avoir été incorporé dans les protéines, fournir une stratégie générale pour manipuler les protéines avec de la lumière. Dans les premiers efforts, ARNt acylé chimiquement avec Uaas photocaged ont été microinjection dans des ovocytes de Xenopus pour incorporer les Uaas dans des récepteurs membranaires et des canaux ioniques 11, qui ont fait progresser la compréhension de leurs relations structure-fonction 12,13,14.Cette approche de microinjection est principalement limitée aux grandes ovocytes. Incorporation génétique d'un Uaa contourne le défi technique ARNt acylation et microinjection en utilisant une paire ARNt / synthétase orthogonale, qui intègre le Uaa grâce à la traduction de protéine endogène dans les cellules vivantes 15,16,17,18. UAA incorporation dans les protéines neuronales a été démontrée dans des neurones primaires et des cellules souches neurales 19,20. Plus récemment, Uaa photoréactif a été génétiquement incorporé dans une protéine neuronale dans le cerveau d'un mammifère in vivo pour la première fois 21. Ces avancées permettent d'étudier les protéines neuronales avec Uaas dans leur environnement cellulaire natif.
Rectification entrante du canal potassique Kir2.1 est un redresseur solide qui passe courants K + plus facilement dans qu'à l' extérieur de la cellule, et il est essentiel dans la régulation des processus physiologiques tels que l' excitabilité cellulaire, le tonus vasculaire, la fréquence cardiaque, reflux de sel finale et la libération d' insuline 22. La surexpression de Kir2.1 hyperpolarise le potentiel de membrane du neurone cible, qui devient moins excitables 23,24. Pour contrôler optiquement Kir2.1 dans ses cellules natives, Kang et al. Génétiquement incorporé un Uaa photo-sensible en Kir2.1 exprimé dans les cellules de mammifères, les neurones et les cerveaux de souris embryonnaires 21. Une brève impulsion de lumière a été en mesure de convertir le Uaa en un acide aminé naturel Cys, activant ainsi la cible protéine Kir2.1. Lorsque cette potassium à rectification entrante (PIRK) protéine de canal photo-inductible de rat a été exprimé dans les neurones hippocampiques primaires, on supprime la décharge neuronale en réponse à l'activation par la lumière. En outre, le canal de PIRK a été exprimé dans le néocortex embryonnaire de la souris et le courant PIRK activé par la lumière dans les neurones corticaux a été mesurée. La mise en œuvre réussie de la technologie Uaa in vivo dans le cerveau des mammifères ouvre la porte à contrôler optiquement protéines neuronalesdans leur environnement natif, ce qui permettra à la dissection optique des processus et des mécanismes neuronaux au niveau moléculaire.
Dans ce protocole , nous décrivons les procédures d'incorporation génétique des Uaas dans les neurones primaires en culture et dans le cerveau de souris embryonnaires in vivo. Le photoréactif Uaa Cmn et Kir2.1 sont utilisés pour illustrer le processus. Des méthodes pour évaluer l'incorporation réussie Uaa et le contrôle optique de l'activité de la protéine neuronale sont fournis. Ce protocole fournit un guide clair génétiquement codant Uaas dans les neurones et in vivo, et de réguler optiquement fonction de la protéine neuronale via un Uaa photosensible. Nous nous attendons à ce protocole pour faciliter l'adoption de la technologie Uaa in vivo pour les neurosciences et les études biologiques optogénétiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour réaliser la photo-modulation efficace, la première étape importante est de décider où incorporer le Uaa photosensible dans la protéine cible. Les informations structurelles et fonctionnelles de la protéine cible est très utile pour guider la sélection des sites candidats. Dans le même temps, le but de la réglementation lumière déterminerait quel site est le plus approprié. Après avoir choisi les sites candidats, nous vous recommandons de tester les sites dans des lignées cellulaires de mammifères t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
Riferimenti
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochimica. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
