שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
לעומת גירוי חשמלי קונבנציונלי, photostimulation מציעה רזולוציה של זמן ומרחב גדול עם הפרעה מינימאלית למערכת הפיזיולוגית של דגימות. מאז ההפגנה של שימוש בלייזר כדי לעורר נוירונים ב -1971 1, בדרכים יצירתיות רבות הומצאו אקסוגני לשלוט הפעילות העצבית עם אור. שחרור אופטי של אגוניסטים photocaged כבר זמן רב בשימוש ללמוד תגובה פיזיולוגית של הרשת העצבית הליגנדים 2,3,4. טכניקה זו הגבילה סגולית עקב דיפוזיה של אגוניסטים בכלוב. סגולי גנטי מושגת ectopically ידי ערוצי opsin רגיש לאור בעת ומשאבות 5,6,7, וזה יושם בהצלחה לווסת רשתות נוירונים שנבחרו אורגניזמים מודל מגוונים. עם זאת, זה יהיה קשה ליישם את השיטה לשלוט אופטי שונים חלבונים עצביים אחרים, מאז השתלת photoresponsiveness מן החלבונים opsin לחלבונים אחרים would דורש הנדסה אינטנסיבית שעשויות לשנות את התכונות הטבעיות של החלבון נחקר. מבחינת כימית קשירה ליגנד רגיש אקסוגניים לחלבון הוכיח דרך נוספת לשלוט על הפונקציונליות של חלבוני ערוץ 8,9,10. ליגנד מוצג או ממדפי אתר הקישור של החלבון דרך photoisomerization של מחצית azobenzene. כימית קשירה מגבילה את היישום בעיקר לצד תאיים של חלבונים בממברנה, למעט הצד התאי וחלבונים תאיים.
Photoresponsive Uaas, לאחר שולבו חלבונים, לספק אסטרטגיה כללית לתמרן חלבונים עם אור. ב המאמצים המוקדמים, tRNAs acylated כימית עם Uaas photocaged היו microinjected לתוך ביציות Xenopus לשלב את Uaas לתוך קולטנים הממברנה תעלות יונים 11, אשר קידמו את ההבנה של יחסי מבנה-תפקידם 12,13,14.גישת microinjection זה מתמצה בעיקר ביציות גדולות. התאגדות גנטית של UAA עוקפת את acylation ו microinjection מאתגר מבחינה הטכנית tRNA באמצעות זוג מאונך tRNA / synthetase, אשר משלב את UAA באמצעות תרגום חלבון אנדוגני בתאי חי 15,16,17,18. UAA התאגדות לחלבונים עצביים הודגמה הנוירונים עיקריים ותאי גזע עצביים 19,20. לאחרונה, photoresponsive UAA כבר שולב גנטי לתוך חלבון עצבי במוח יונקי in vivo בפעם הראשונה 21. התקדמות אלה מאפשרים ללמוד חלבונים עצביים עם Uaas בסביבת הסלולר מולדתם.
כלפי פנים Kir2.1 ערוץ אשלגן לתיקון הוא מיישר חזק שעובר K + זרמים יותר בקלות לתוך מאשר מחוץ לתא, והוא חיוני בוויסות תהליכים פיזיולוגיים כולל רגישות התא, הטון של כלי הדם, קצב הלב, מחדשזרימת מלח סופית ואינסולין לשחרר 22. התבטאות יתר של Kir2.1 hyperpolarizes פוטנציאל הממברנה של הנוירון היעד, אשר הופך להיות פחות 23,24 להתרגש. כדי לשלוט Kir2.1 אופטית בתאים המקוריים שלו, קאנג et al. מאוגד גנטי תמונת מגיבי UAA לתוך Kir2.1 לידי הביטוי בתאי יונקים, נוירונים מוח עכבר עוברי 21. דופק קצר של אור הצליח להמיר את UAA לתוך חומצה אמינית טבעית Cys, ובכך הפעלת חלבון Kir2.1 היעד. כאשר אשלגן צילום מושרה זה לתיקון כלפי פנים (PIRK) חלבון ערוץ התבטא הנוירונים עיקריים בהיפוקמפוס עכברוש, הוא הדחיק ירי עצבי בתגובת הפעלת אור. בנוסף, ערוץ PIRK התבטא הניאוקורטקס העכבר העוברי, וזרם האור מופעל PIRK ב נוירונים בקליפת המוח נמדד. היישום המוצלח של טכנולוגית UAA in vivo במוח היונקים פותח את הדלת כדי לשלוט אופטי חלבונים עצבייםבסביבה האם שלהם, אשר תאפשר לנתיחה אופטית של תהליכים ומנגנונים עצביים ברמה המולקולרית.
בפרוטוקול זה אנו מתארים הליכי התאגדות גנטית של Uaas לתוך הנוירונים עיקריים בתרבות במוח העכבר העוברי in vivo. Photoresponsive UAA CMN ו Kir2.1 משמש כדי להמחיש את התהליך. שיטות להעריך התאגדות UAA מוצלחת שליטה אופטית של פעילות חלבון עצבית מסופקות. פרוטוקול זה מספק מדריך ברור גנטי קידוד Uaas בנוירונים ובחי, וכדי אופטי ויסות תפקוד חלבון עצבי באמצעות UAA photoresponsive. אנו מצפים פרוטוקול זה כדי להקל על אימוץ הטכנולוגיה in vivo UAA עבור הנוירולוגיה מחקרים ביולוגיים optogenetic.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג צילום אפנון יעיל, השלב הראשוני החשוב הוא להחליט היכן לשלב את UAA photoresponsive ב חלבון המטרה. מידע מבני ותפקודי של חלבון המטרה מאוד עוזר להנחות את הבחירה של אתרי מועמדים. במקביל, לעניין תקנת אור היה לקבוע איזה אתר הוא מתאים ביותר. לאחר בחירת אתרי מועמדים, אנו ממליצי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
Riferimenti
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochimica. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
