Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
Rispetto alla stimolazione elettrica convenzionale, fotostimolazione offre una maggiore risoluzione temporale e spaziale, con un minimo al sistema fisiologico di esemplari. Dal momento che la manifestazione di utilizzare il laser per stimolare i neuroni nel 1971 1, molti modi creativi sono stati inventati per controllare esogena attività neuronale con la luce. Rilascio ottica di agonisti photocaged è stato a lungo utilizzato per studiare la risposta fisiologica della rete neuronale di ligandi 2,3,4. Questa tecnica ha limitato specificità dovuta alla diffusione di agonisti gabbia. Specificità genetica si ottiene che esprimono canali ectopicamente opsine sensibili alla luce e pompe 5,6,7, ed è stato applicato con successo per modulare reti neuronali selezionati in diversi organismi modello. Tuttavia, sarebbe difficile applicare questo metodo per controllare otticamente varie altre proteine neuronali, poiché l'innesto photoresponsiveness dalle proteine opsin ad altre proteine would richiedono engineering intensa che possono alterare le caratteristiche naturali della proteina in esame. Chimicamente legare un ligando esogeno fotosensibile ad una proteina ha dimostrato un altro modo per controllare la funzionalità delle proteine canale 8,9,10. Il legante è presentato o ritirato dal sito di legame della proteina attraverso la fotoisomerizzazione della porzione azobenzene. Tethering chimica limita l'applicazione principalmente al lato extracellulare di proteine di membrana, escludendo il lato intracellulare e proteine intracellulari.
Fotoresponsivi Uaas, dopo essere stato incorporato nelle proteine, forniscono una strategia generale per manipolare le proteine con la luce. Nel primi sforzi, tRNA acilata chimicamente con Uaas photocaged stati microiniettati in ovociti di Xenopus per incorporare le Uaas in recettori di membrana e canali ionici 11, che hanno avanzato la comprensione delle loro relazioni struttura-funzione 12,13,14.Questo approccio microiniezione è principalmente limitata alle grandi ovociti. Costituzione genetica di una SAU bypassa il tecnicamente impegnativo tRNA acilazione e microiniezione utilizzando una coppia di tRNA / sintetasi ortogonale, che incorpora la SAU attraverso la traduzione della proteina endogena in cellule vive 15,16,17,18. SAU incorporazione in proteine neuronali è stata dimostrata in neuroni primari e le cellule staminali neurali 19,20. Più recentemente, fotosensibile SAU è stata geneticamente incorporato in una proteina neuronale nel cervello dei mammiferi in vivo per la prima volta 21. Questi progressi permettono di studiare le proteine neuronali con Uaas nel loro ambiente cellulare nativo.
Canale del potassio Rettificante internamente Kir2.1 è un forte raddrizzatore che passa K + correnti più facilmente in quanto dalla cellula, ed è essenziale nella regolazione dei processi fisiologici tra cui eccitabilità cellulare, tono vascolare, frequenza cardiaca, reflusso di sale finale e rilascio di insulina 22. Sovraespressione di Kir2.1 Hyperpolarizes del potenziale di membrana del neurone bersaglio, che diventa meno eccitabile 23,24. Per controllare otticamente Kir2.1 nelle sue cellule native, Kang et al. Geneticamente incorporato una foto-sensibile SAU in Kir2.1 espresso in cellule di mammifero, i neuroni e cervello embrionali di topo 21. Un breve impulso di luce è in grado di convertire il SAU in un amminoacido naturale Cys, attivando così la proteina Kir2.1 bersaglio. Quando questa foto-inducibile canale proteina interiormente rettificazione potassio (Pirk) è stato espresso in ratto neuroni ippocampali primari, è soppressa neuronale in risposta all'attivazione luce. Inoltre, il canale Pirk stato espresso nella neocorteccia embrionali di topo, e la corrente di luce-attivato Pirk nei neuroni corticali è stato misurato. Il successo dell'attuazione della tecnologia SAU in vivo nel cervello dei mammiferi si apre la porta per controllare otticamente proteine neuronalinel loro ambiente nativo, che permetterà la dissezione ottica di processi neuronali e meccanismi a livello molecolare.
In questo protocollo si descrivono le procedure per incorporazione genetica di Uaas in neuroni primari nella cultura e nel cervello embrionale del mouse in vivo. Il fotosensibile SAU Cmn e Kir2.1 sono utilizzati per illustrare il processo. I metodi per valutare il successo incorporazione SAU e controllo ottico di attività della proteina neuronale sono forniti. Questo protocollo fornisce una guida chiara per geneticamente codifica Uaas nei neuroni e in vivo, e alla regolamentazione otticamente la funzione delle proteine neuronali attraverso una SAU fotosensibile. Ci aspettiamo che questo protocollo per facilitare l'adozione della tecnologia in vivo SAU per le neuroscienze e studi biologici optogenetic.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per raggiungere efficace foto-modulazione, l'importante primo passo è quello di decidere dove incorporare il fotosensibile SAU nella proteina bersaglio. informazioni strutturali e funzionali della proteina bersaglio è molto utile per guidare la selezione dei siti candidati. Allo stesso tempo, allo scopo di regolazione della luce sarebbe determinare quale sito è più adatto. Dopo aver scelto i siti candidati, si consiglia di testare i siti in linee cellulari di mammiferi come il rene embrionale umano (HEK) celle p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
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