뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
종래의 전기 자극에 비해 photostimulation는 시편의 생리적 시스템에 최소한의 간섭이 큰 시간과 공간 분해능을 제공합니다. 1971 1 뉴런을 자극하는 레이저를 사용하여 데모 때문에 많은 창의적인 방법은 외인성 광 신경 세포 활성도를 조절하도록 고안되었다. photocaged 작용제의 광 방출은 긴 리간드 2,3,4에 신경 네트워크의 생리적 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 기술로 인해 갇힌 작용제의 확산에 특이성을 제한하고있다. 유전 적 특이성은 ectopically 표현하는 빛에 민감한 옵신 채널에 의해 달성 5,6,7 펌프, 그리고 성공적으로 다양한 모델 생물에서 선택한 신경 네트워크를 조절하는 적용된된다. 그러나, 다른 단백질로 옵신 단백질로부터 photoresponsiveness 그래프트 때문에, 각종 광학 신경 단백질을 제어하기 위해이 방법을 적용하기 어렵다 woul연구중인 단백질의 고유 특성을 변경할 수 강렬한 공학 필요할 거라고. 화학적 단백질 외인성 감광성 리간드 채널 8,9,10 단백질의 기능을 제어하는 다른 방법을 설명했다 테 더링. 리간드 제시하거나 아조벤젠 부분의 광 이성화를 통해 단백질의 결합 부위로부터 배출된다. 더링 화학 세포 내 측면 및 세포 내 단백질을 제외하고, 주로 막 단백질의 세포 외 측 애플리케이션을 제한한다.
광 감응성 Uaas는 단백질에 통합 된 후, 광 단백질을 조작 할 수있는 일반적인 전략을 제공합니다. photocaged Uaas 그들의 구조 – 기능 관계 12,13,14 이해를 고급 막 수용체 이온 채널 (11)로 Uaas를 통합하는 제노 푸스 난 모세포에 미세 주입 하였다 이른 노력에서 tRNA를 화학적 실화.이 미세 주입 방식은 주로 큰 난자로 제한됩니다. UAA 유전 혼입 생균 15,16,17,18에서 내인성 단백질 번역을 통해 UAA를 포함하는 직교의 tRNA / 합성 쌍을 사용하여 아실 tRNA에 미세 주입 및 기술적 도전을 우회. 신경 세포의 단백질로 UAA의 통합은 기본 신경 세포와 신경 줄기 세포 (19, 20)에서 입증되었다. 최근 광 감응성 UAA 유전자 처음 21 생체 내에서 포유 동물의 뇌에서 신경 세포 단백질에 통합되었다. 이러한 발전은 그 나라의 셀룰러 환경에서 Uaas와의 연결 단백질을 연구하는 것이 가능합니다.
내향 정류 칼륨 채널 Kir2.1 셀 중 이상으로보다 용이 K + 전류를 통과 강한 정류기이며, 흥분성 세포, 혈관 톤, 심박수, 재를 포함한 생리 과정 조절에 필수적인최종 소금 흐름과 인슐린 (22)를 놓습니다. Kir2.1 과발현 이하 흥분성 23,24된다 표적 뉴런의 막전위를 hyperpolarizes. 광학의 기본 세포에서 Kir2.1를 제어하려면, 강 등은. 유전자 Kir2.1에 사진 응답 UAA는 포유 동물 세포, 신경 세포 및 배아 마우스의 뇌 (21)로 표현 된 통합. 빛의 짧은 펄스 따라서 목표 Kir2.1 단백질의 활성화, 천연 아미노산을 시스테인으로 변환 UAA 수 있었다. 이 사진 – 유도 내향 정류 칼륨 (PIRK) 채널 단백질 래트 해마 뉴런의 기본 발현되면, 광 활성화에 응답 신경원 발화를 억제 하였다. 또한 PIRK 채널은 마우스 배아 신피질로 표현하고, 대뇌 피질의 신경 세포에 광 활성화 PIRK 전류를 측정 하였다. 포유 동물 뇌의 생체 내에서 UAA 기술의 성공적인 구현은 광학 신경 단백질을 제어하는 문을 열어그 나라의 환경에서, 분자 레벨에서의 연결 프로세스 및 메커니즘 광 박리를 가능하게한다.
이 프로토콜에서 우리는 문화와 생체 내에서 배아 마우스 뇌의 기본 뉴런에 Uaas의 유전 설립을위한 절차를 설명합니다. 감응성 UAA CMN 및 Kir2.1 과정을 설명하기 위해 사용된다. 방법 성공 UAA의 통합 및 제공되는 신경 세포의 단백질 활성의 광학 제어를 평가합니다. 이 프로토콜은 유전자 신경 세포와 생체 내에서 Uaas를 인코딩 및 광학적 광 감응성 UAA를 통해 신경 세포의 단백질 기능을 조절하는 데에 명확한 지침을 제공합니다. 우리는이 프로토콜은 신경 과학 및 optogenetic 생물학적 연구를위한 생체 UAA 기술의 채택을 촉진 할 전망이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효율적인 광 변조를 달성하기 위해, 중요한 초기 단계 여기서 표적 단백질의 감응성 UAA를 통합하기로 결정한다. 표적 단백질의 구조 및 기능 정보는 후보 위치의 선택을 안내하기 위해 매우 유용하다. 동시에, 광 조절의 목적은 최적 인 위치를 결정한다. 후보 사이트를 선택한 후, 우리는 차 신경 세포와 생체 내에서 진행하기 전에 이러한 인간 배아 신장 (HEK) 쉽게 문화와 조작을위한 세포?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
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