Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
Em comparação com a estimulação elétrica convencional, fotoestimulação oferece maior resolução temporal e espacial com a mínima interferência no sistema fisiológico das amostras. Desde a demonstração do uso de lasers para estimular neurônios em 1971 1, muitas maneiras criativas foram inventados para controlar exogenamente atividade neuronal com a luz. Libertação óptica de agonistas photocaged tem sido muito utilizado para estudar a resposta fisiológica da rede neuronal para ligandos 2,3,4. Esta técnica tem limitado especificidade devido à difusão de agonistas enjaulados. Especificidade genética é conseguido por ectopicamente que expressam canais de opsina sensíveis à luz e bombas de 5,6,7, e que tem sido aplicado com sucesso para modular redes neuronais seleccionadas em diversos organismos modelo. No entanto, seria difícil de aplicar este método para controlar opticamente várias outras proteínas neuronais, uma vez que enxertia photoresponsiveness das proteínas a outras proteínas opsina acolherá-D necessitam de engenharia intenso que podem alterar as características naturais da proteína em estudo. Quimicamente amarrar um ligando fotossensível exógeno a uma proteína demonstrou uma outra maneira de controlar a funcionalidade de proteínas de canal 8,9,10. O ligando é apresentado ou retirado do local de ligação da proteína através da foto-isomerização da porção azobenzeno. Partilha química limita a aplicação, principalmente, para o lado extracelular de proteínas de membrana, excluindo o lado intracelular e proteínas intracelulares.
Fotossensíveis UAAS, depois de ter sido incorporada em proteínas, fornecer uma estratégia geral para manipular proteínas com luz. Em esforços iniciais, tRNAs quimicamente acilados com UAAS photocaged receberam microinjeções em oócitos de Xenopus para incorporar as UAAS em receptores de membrana e canais iônicos 11, que têm avançado a compreensão de suas relações estrutura-função 12,13,14.Esta abordagem microinjeção é limitado principalmente para grandes oócitos. Incorporação genética de uma Uaa ignora o desafio técnico tRNA acilação e microinjecção usando um par ARNt / sintetase ortogonal, que incorpora SAU através da tradução de proteína endógena em células vivas 15,16,17,18. Uaa incorporação proteínas neuronais tem sido demonstrada em neurónios primárias e células estaminais neurais 19,20. Mais recentemente, fotossensíveis Uaa foi geneticamente incorporada uma proteína neuronal no cérebro de mamíferos, in vivo, pela primeira vez 21. Estes avanços tornam possível estudar proteínas neuronais com UAAS no seu ambiente celular nativo.
Interiormente retificação do canal de potássio Kir2.1 é um forte retificador que passa K + correntes mais facilmente em que para fora da célula, e é essencial na regulação de processos fisiológicos incluindo excitabilidade das células, tônus vascular, a frequência cardíaca, refluxo sal nal e insulina liberar 22. A sobre-expressão de Kir2.1 hiperpolariza o potencial de membrana do neurónio-alvo, que se torna menos excitável 23,24. Para controlar opticamente Kir2.1 nas suas células nativas, Kang et ai. Geneticamente incorporou um Uaa foto-sensível em Kir2.1 expresso em células de mamíferos, os neurónios e cérebro do rato embriónica 21. Uma breve pulso de luz foi capaz de converter o EAU em um aminoácido natural Cys, activando assim a proteína Kir2.1 alvo. Quando esta proteína de canal de foto-indutível interiormente rectificação de potássio (Pirk) foi expresso em neurónios primários do hipocampo do rato, que suprimiu o disparo neuronal em resposta à activação de luz. Além disso, o canal Pirk foi expressa no neocórtex de rato embrionário, e a corrente activado pela luz Pirk em neurónios corticais foi medida. A implementação bem sucedida da tecnologia Uaa in vivo no cérebro de mamíferos abre a porta para controlar opticamente proteínas neuronaisno seu ambiente nativo, o que permitirá dissecção óptico dos processos e mecanismos neuronais, a nível molecular.
Neste protocolo, descrevemos os procedimentos para a constituição genética de UAAS em neurônios primários na cultura e no cérebro do rato embrionário in vivo. O fotossensíveis Uaa CMN e Kir2.1 são utilizados para ilustrar o processo. Métodos para avaliar bem-sucedida incorporação Uaa e controle óptico da actividade da proteína neuronal são fornecidos. Este protocolo fornece um guia claro para codificar geneticamente UAAS em neurônios e in vivo, e para a regulação opticamente função da proteína neuronal através de um Uaa fotossensíveis. Esperamos que este protocolo para facilitar a adoção da tecnologia in vivo Uaa para a neurociência e estudos biológicos optogenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para alcançar photo-modulação eficaz, o passo inicial importante é decidir onde a incorporar SAU fotossensíveis na proteína alvo. A informação estrutural e funcional da proteína alvo é muito útil para orientar a selecção de locais candidatos. Ao mesmo tempo, o efeito de regulação da luz iria determinar que o local é o mais adequado. Depois de escolher locais candidatos, é recomendável para testar os sítios em linhas celulares de mamíferos, tais como o rim embrionário humano (HEK) células de cultura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
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