Методы Обнаружение использования альтернативных Promoter и транскрипционной регуляции мышиных Bcrp1
Summary
С помощью мышиного ABC транспортером Bcrp1 (ABCG2) в качестве примера, в-силикомарганца протоколы представлены для обнаружения альтернативного использования промотора генов экспрессируются в тканях мышей, а также для оценки функциональных возможностей альтернативных промоторов , идентифицированных с использованием репортерных анализов.
Abstract
экспрессии генов в различных тканях, часто под контролем альтернативных промоторов, которые приводят к синтезу мРНК с уникальным – обычно непереведенных – первые экзоны. Bcrp1 (ABCG2), мышиный ортолог на ABC транспортером груди белка устойчивости рака (BCRP, ABCG2), имеет, по меньшей мере, четыре альтернативных промоторов, которые определены соответствующими четырьмя альтернативными первых экзонов производства: E1u, Е1А, Е1В и Е1С. При этом, в-силикомарганца протоколы представлены для прогнозирования альтернативного использования промотора для Bcrp1. Кроме того, методы репортер анализа описаны для получения репортерные конструкции для альтернативных промоторов и определить функциональные возможности предполагаемыми промоторов вверх по течению от альтернативного первых экзонов, которые обозначены.
Introduction
Более половины генов человека регулируются альтернативными промоторами 1. Каждый альтернативный промотор может содержать регуляторные элементы, которые могут отличаться от тех, в других альтернативных промоторов. Промотор (ы), используемые в одной ткани могут отличаться от тех, которые использовались в других тканях. Например, вполне возможно, что активация данного сигнального пути, может вызвать альтернативный промотор гена, используемого в одной ткани, но не оказывают никакого влияния на или репрессировать отдельный альтернативный промотор для того же самого гена, который используется в другой ткани.
Экспрессия гена Bcrp1 определяется альтернативными промоторами. Bcrp1 является мышиная ортолог гена человеческого груди Сопротивление рака протеина (BCRP). BCRP является АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеру, официально назначенный ABCG2 2, 3. В качестве верхушечного мембранного белка плазмы, BCRP / функции Bcrp1 в оттоке широкий спектр природных и ксенобиотиков субстратов <suр> 3, 4. У человека и у мышей, BCRP / Bcrp1 высоко выражена в фармакологически соответствующих органов , таких как печень (желчные канальцы), кишечника и почек, а также органов с кровью ткани диафрагм , таких как плацента, мозг и семенниках 2, 5 – 12. Выражение BCRP / Bcrp1 в кроветворных и других стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, может придавать резистентность этих клеток к ксенобиотиков и противораковых химиотерапевтических препаратов 3.
В начале работы , чтобы понять регуляции экспрессии BCRP в нормальных и опухолевых клеток, 5 'быстрой амплификации концов кДНК (5'-RACE) анализ мРНК BCRP было проведено с целью определения его запуска сайта точной транскрипции 13. Мало того, были множественные сайты начала транскрипции найдено; Также встречаются три альтернативные формы первого экзона, который в BCRP является непереведенными. Эти альтернативные первые экзоны – назначенные E1a, E1b, E1C – были выражены по-разному в различных тканях человека. Два дополнительных первые варианты экзонов были обнаружены в поисках BLAST человеческой базе данных EST с использованием второго экзона BCRP 13. Четыре матча показали первый экзон> 70 кб вверх по течению от экзона 2, которые были назначены E1u; четыре матча показали мРНК BCRP , что не хватало первого экзона полностью, которые были обозначены E1- 13. Наличие альтернативных экзонов лидера считается проявлением использования альтернативного промотора 14.
У мышей четыре альтернативных первые экзоны Bcrp1 описаны , которые могут соответствовать альтернативным промоторы , которые регулируют BCRP 1 транскрипцию в различных тканях мыши; эти экзоны / промоутеры обозначены E1u, Е1А, Е1В и Е1С, и расположены примерно в 70, 58, 15 и 5 кб вверх по течению от Bcrp1 экзона 2 5, 15. Изоформы Е1А мРНК было обнаружено, что преобладающей в Муринае гемопоэтические стволовые клетки, сердца, легких, селезенке и головном мозге, в то время как было выражено изоформы Е1В в кишечнике мыши, клеток печени плода, а также клетки – предшественники эритроидных в костном мозге 5, 15. Промотор вверх по течению от Е1В было показано, что основной альтернативный промотор, регулирующий Bcrp1 транскрипцию в кишечнике мыши, регулируется по меньшей мере, частично, с помощью фосфо-циклического АМФ элемент ответа связывания с белками (п-CREB) и элемент ответа CREB, уникальную для альтернативы Bcrp1 промотор 16. Изоформы Е1С мРНК преимущественно экспрессируется во взрослом мышиной печени и почек 5. Изоформы E1U не обнаруживается в большинстве тканей , протестированных на мышиных семенников, где она является преобладающей изоформы , выраженной 5 за исключением того . Bcrp1 выражается в яичках крыс обнаруживается в обоих соматическими (эндотелиальные плотные соединения, перитубулярных myoid клеток и клеток Сертоли) и половых клеток (в семенных эндотелием, где он может защитить поздней стадии сперматиды 4). региона вверх по течению от E1u содержит функциональный элемент ответа на стероидогенной фактор-1 (SF-1) 5. Bcrp1 мРНК и белка заметно снижается в яичках клеточных специфических нокаутных мышей Сертоли SF-1, предполагая , что экспрессия Bcrp1 в мышиных клетках Сертоли контролируется SF-1 5.
Протоколы , представленные методы подробно , чтобы обнаружить альтернативные первые экзонов Bcrp1 в-силикомарганца и установить люциферазы на основе репортерных анализов для предполагаемых промоутеров вверх по течению от альтернативных экзонов первых выявленных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство методов и репрезентативных результатов , представленных описаны в предыдущей работе , озаглавленной "B CRP1 транскрипции в семенниках мыши контролируется промотором перед новым первого экзона (E1u) регулируется стероидогенной фактор-1" , который был опубликован в 2013 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Merit Review Awards Дуглас Д. Росс и Ариф Хуссейн из Департамента по делам ветеранов.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Riferimenti
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
