Méthodes à découvrir Alternative Utilisation de promoteur et la régulation transcriptionnelle de Murine BCRP1
Summary
Avec les anticorps monoclonaux transporteur ABC BCRP1 (ABCG2) à titre d'exemple, dans le silico protocoles sont présentés pour détecter l' usage alternatif du promoteur des gènes exprimés dans des tissus de souris, et pour évaluer la fonctionnalité des promoteurs alternatifs identifiés en utilisant des dosages de rapporteur.
Abstract
L'expression des gènes dans différents tissus est souvent contrôlée par des promoteurs alternatifs qui aboutissent à la synthèse d'ARNm avec uniques – – généralement non traduites premiers exons. BCRP1 (ABCG2), l'orthologue murin de l'ABC Breast transporteur Résistance cancer Protein (BCRP, ABCG2), a au moins quatre autres promoteurs qui sont désignés par les quatre premiers exons correspondants alternatifs produits: E1U, E1A, E1B et E1C. Ici, in-silico protocoles sont présentés pour prédire l' utilisation de promoteur alternative pour BCRP1. En outre, les méthodes de dosage de rapporteur sont décrits pour produire des constructions rapporteurs de promoteurs alternatifs et pour déterminer la fonction de promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.
Introduction
Plus de la moitié des gènes humains sont réglementés par des promoteurs alternatifs 1. Chaque promoteur alternative peut contenir des éléments régulateurs qui peuvent être différentes de celles des autres promoteurs alternatifs. Le promoteur (s) utilisé dans un tissu peut être différent de ceux utilisés dans un autre tissu. Par exemple, il est possible que l'activation d'une voie de signalisation donnée peut déclencher le promoteur d'un gène de remplacement utilisé dans un tissu, mais n'a aucun effet sur ou réprimer un promoteur alternatif distinct pour le même gène qui est utilisé dans un autre tissu.
L'expression du gène BCRP1 est régie par des promoteurs alternatifs. BCRP1 est l'orthologue murin du gène humain du sein Cancer Resistance Protein (BCRP). BCRP est une cassette de liaison à l' ATP (ABC) transporteur, officiellement désigné ABCG2 2, 3. En tant que plasma protéine de la membrane apicale, BCRP Fonctions / BCRP1 à efflux une grande variété de substrats naturels et xénobiotiques <sup> 3, 4. Chez les humains et les souris, BCRP / BCRP1 est fortement exprimé dans les organes pharmacologiquement appropriés tels que le foie (canalicules biliaires), l' intestin et du rein, ainsi que les organes des barrières hémato-tissus , tels que le placenta, le cerveau et les testicules 2, 5-12. L' expression de BCRP / BCRP1 dans hématopoïétiques et d' autres cellules souches, y compris les cellules souches du cancer, peut conférer une résistance de ces cellules à des xénobiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques cancer 3.
Dans le travail tôt pour comprendre la régulation de l' expression de BCRP dans les cellules normales et néoplasiques, 5 'amplification rapide des extrémités d'ADNc (5'-RACE) analyse de BCRP ARNm a été réalisée afin de déterminer son site de départ de la transcription exacte 13. Non seulement plusieurs sites de début de transcription trouvés; rencontre également, trois variantes du premier exon, qui est non traduite BCRP. Ces alternatives premiers exons – désignés E1a, E1B E1c – ont été exprimés différemment dans une variété de tissus humains. Deux variantes supplémentaires premier exon ont été découverts dans une recherche BLAST de la base de données EST humaine en utilisant le second exon de BCRP 13. Quatre résultats ont révélé un premier exon> 70 kb en amont de l'exon 2 qui ont été désignés E1U; quatre autres matches ont révélé BCRP ARNm qui manquait un premier exon entièrement, qui ont été désignés E1- 13. La présence d'exons alternatifs leader est considéré comme une manifestation de l' utilisation du promoteur alternatif 14.
Chez la souris, quatre autres premiers exons de BCRP1 sont décrits qui peuvent correspondre à des promoteurs alternatifs qui régissent Bcrp 1 transcription dans les tissus de souris différentes; Ces promoteurs / exons sont désignés E1U E1A, E1B et E1C et sont situés à environ 70, 58, 15 et 5 kb en amont de l' exon 2 BCRP1 5, 15. L'isoforme E1A de l'ARNm a été jugée prédominante dans Murine des cellules souches hématopoïétiques, le cœur, le poumon, la rate et le cerveau, tandis que l'isoforme E1B a été exprimé dans l' intestin de souris, des cellules hépatiques foetales et des cellules précurseurs érythroïdes dans la moelle osseuse 5, 15. Le promoteur en amont de E1B a été démontré que le promoteur majeur alternatif régissant BCRP1 la transcription dans l'intestin de la souris, régulée au moins en partie, par phospho-AMP cyclique protéine élément de réponse de liaison (p-CREB) et un élément de réponse à CREB unique à cette variante BCRP1 promoteur 16. L'isoforme E1C ARNm est exprimé de manière prédominante dans le foie et le rein de souris adulte 5. L'isoforme E1U est indétectable dans la plupart des tissus testés à l' exception des testicules de souris, où il est l'isoforme dominante exprimée 5. BCRP1 exprimé dans les testicules de rat se trouve dans les deux (jonctions endothéliales serrées, les cellules myoïdes péritubulaires, et les cellules de Sertoli) somatiques et les cellules germinales (dans l'endothélium séminifère, où il peut protéger spermatides stade avancé 4). Le regd' ions en amont de E1U contient un élément de réponse fonctionnelle pour stéroïdogénique factor-1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm et la protéine sont nettement réduits dans les testicules de SF-1 souris knockout spécifiques des cellules de Sertoli, suggérant que l' expression BCRP1 dans les cellules de Sertoli murines est contrôlé par SF-1 5.
Les protocoles présentés détail les méthodes pour détecter d' autres premiers exons de BCRP1 in silico, et d'établir des dosages de rapporteur à base de luciférase pour les promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La majorité des méthodes et des résultats représentatifs présentés sont décrits dans les travaux antérieurs intitulé "B CRP1 transcription dans les testicules de souris est contrôlée par un promoteur en amont d'un premier roman exon (E1U) régulé par stéroïdogénique factor-1," qui a été publié en 2013 5 . En plus des résultats représentatifs décrits ici, le document précédent a fourni des estimations de remplacement première utilisation de l'exon en utilisant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le mérite examen des prix à Douglas D. Ross et à Arif Hussain du ministère des Anciens Combattants.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Riferimenti
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