Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken
Summary
Mit dem murinen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als Beispiel in-silico – Protokolle werden dargestellt , um alternative Promotor Gebrauch in Gene in Mausgeweben exprimiert erkennen und die Funktionalität der alternativen Promotoren unter Verwendung von Reporter – Assays identifiziert , zu bewerten.
Abstract
Genexpression in verschiedenen Geweben wird häufig durch alternative Promotoren gesteuert, die bei der Synthese der mRNA resultieren mit einzigartigen – in der Regel nicht-translatierten – erste Exons. Bcrp1 (ABCG2), der murine Ortholog des Protein ABC transporter Breast Cancer Resistance (BCRP, ABCG2) hat mindestens vier alternative Promotoren, die von den entsprechenden vier alternativen ersten Exons hergestellt bezeichnet sind: E1U, E1A, E1B und E1C. Hier in-silico – Protokolle werden vorgestellt für Bcrp1 alternative Promotor Gebrauch zu prognostizieren. Weiterhin sind, reporter Assayverfahren beschrieben Reporterkonstrukten für alternative Promotoren zu erzeugen, und die Funktionalität von putativen Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu bestimmen, die gekennzeichnet sind.
Introduction
Mehr als die Hälfte der menschlichen Gene sind 1 durch alternative Promotoren geregelt. Jede alternative Promotor kann regulatorische Elemente enthalten, die sich von denen in anderen alternativen Promotoren voneinander verschieden sein können. Der Promotor (en) in einem Gewebe verwendet werden, können sich von denen in einem anderen Gewebe verwendet werden, unterscheiden. Beispielsweise ist es möglich, dass die Aktivierung eines bestimmten Signalwegs die alternative Promotor für ein Gen in einem Gewebe verwendet auslösen können, aber keine Wirkung auf oder eine separate alternative Promotor für das gleiche Gen unterdrücken, die in einem anderen Gewebe verwendet wird.
Expression des Gens wird durch Bcrp1 alternative Promotoren geregelt. Bcrp1 ist die murine Ortholog des menschlichen Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) -Gen. BCRP ist ein ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporter, förmlich festgelegten ABCG2 2, 3. Als apikalen Plasmamembranprotein, BCRP / Bcrp1 Funktionen eine Vielzahl von natürlichen und xenobiotic Substrate Ausströmen <sup> 3, 4. Bei Menschen und Mäusen, BCRP / Bcrp1 ist hoch in pharmakologisch relevanten Organe wie Leber (Gallenkanälchen), Darm und Niere, sowie Organe mit Blut-Gewebe – Barrieren wie Placenta, Hirn und Hoden 2 ausgedrückt, 5-12. Expression von BCRP / Bcrp1 in hämatopoetischen und anderen Stammzellen, einschließlich Krebsstammzellen kann Resistenz dieser Zellen Xenobiotika und Krebs chemotherapeutischen Medikamenten verleihen 3.
In frühen Arbeiten die Regulierung der BCRP – Expression in normalen und neoplastischen Zellen, 5 'RACE-PCR (5'-RACE) Analyse der BCRP mRNA zu verstehen , wurde durchgeführt , seine genaue Transkriptionsstartstelle 13 zu bestimmen. Nicht nur waren mehrere Transkriptionsstartstellen gefunden; waren ebenfalls drei alternative Formen des ersten Exons, die in BCRP-untranslatierten auftritt. Diese alternativen ersten Exons – bezeichnet E1a, E1b, E1c – wurden unterschiedlich in einer Vielzahl von menschlichen Geweben exprimiert. Zwei weitere erste Exon – Varianten wurden in einer BLAST – Suche der menschlichen EST – Datenbank unter Verwendung des zweiten Exon von BCRP 13 entdeckt. Vier Begegnungen ergab eine erste Exon> 70 kb stromaufwärts von Exon 2, die E1U bezeichnet wurden; vier anderen Spielen ergab BCRP mRNA , die ein erstes Exon völlig fehlte, die E1- 13 bezeichnet wurden. Das Vorhandensein alternativer Führer Exons wird als 14 eine Manifestation von alternativen Promotor Nutzung zu sein.
Bei Mäusen vier alternative erste Exons von Bcrp1 beschrieben , die auf alternative Promotoren entsprechen , die Bcrp 1 Transkription in verschiedenen Geweben der Maus steuern; Diese Exons / Promotoren bezeichnet werden E1U, E1A, E1B und E1C und sind etwa 70, 58, 15 und 5 kb stromaufwärts von Exon 2 Bcrp1 5, 15 befindet. Die E1A mRNA Isoform wurde vorherrschend in Murin gefundene hämatopoetischen Stammzellen, Herz, Lunge, Milz und Gehirn, während die E1B – Isoform in Mausdarm, fetales exprimiert wurde , Leberzellen und erythroiden Vorläuferzellen in Knochenmark 5, 15. Der Promotor stromaufwärts von E1B wurde gezeigt, dass die Haupt alternative Promotor regeln Bcrp1 Transkription in Mausdarm zu sein, zumindest teilweise geregelt, indem phospho-zyklisches-AMP-Antwortelement bindendes Protein (p-CREB) und einem CREB-Response-Element einzigartig für diese alternative Bcrp1 Promotor 16. Die E1C mRNA Isoform überwiegend bei erwachsenen Maus – Leber und Niere 5 ausgedrückt. Die E1U Isoform ist nicht nachweisbar in den meisten getesteten Geweben mit Ausnahme von Mäusehoden, wo sie die vorherrschende Isoform 5 ausgedrückt. Bcrp1 ausgedrückt in Hoden von Ratten in beiden somatischen (endothelial tight junctions, peritubulären myoid Zellen und Sertoli – Zellen) gefunden und Keimzellen (in der seminiferous Endothel, wo es im Spätstadium spermatids 4 schützen kann). Die regIonen stromaufwärts von E1U enthält eine funktionelle Antwortelement für steroidogenen factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA und Protein werden in den Hoden von Sertoli zellspezifischen SF-1 – Knockout – Mäusen deutlich reduziert, was darauf hindeutet , dass Bcrp1 Expression in murinen Sertoli – Zellen durch SF-1 gesteuert wird , 5.
Die Protokolle Detail Methoden vorgestellt alternativen ersten Exons von Bcrp1 in-silico zu detektieren und identifiziert Luciferase-basierten Reporterassays für putative Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Mehrzahl der Methoden und repräsentative Ergebnisse sind in früheren Arbeit mit dem Titel beschrieben "B CRP1 Transkription in Maus Hoden wird durch einen Promotor kontrolliert vor einem neuen ersten Exons (E1U) durch steroidogenen factor-1 reguliert" , die im Jahr 2013 5 veröffentlicht . Zusätzlich zu den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen, sofern die vorherige Papier Schätzungen von alternativen ersten Exons Nutzungs 5'-RACE PCR und RT-PCR-Methodik. Darüber hina…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Merit Review Awards Douglas D. Ross und Arif Hussain aus dem Department of Veterans 'Affairs unterstützt.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Riferimenti
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