तरीके वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग और murine Bcrp1 की Transcriptional नियमन डिस्कवर के लिए
Summary
Murine एबीसी ट्रांसपोर्टर Bcrp1 (Abcg2) एक उदाहरण के रूप में साथ में सिलिको प्रोटोकॉल माउस ऊतकों में व्यक्त जीनों में वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग पता लगाने के लिए, और रिपोर्टर assays का उपयोग पहचान वैकल्पिक प्रमोटरों की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं।
Abstract
आम तौर पर ग़ैर-अनुवादित – – पहले एक्सॉनों विभिन्न ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति अक्सर वैकल्पिक प्रमोटरों कि अद्वितीय साथ mRNA के संश्लेषण में परिणाम द्वारा नियंत्रित किया जाता है। E1U, E1A, E1B, और E1C: Bcrp1 (Abcg2), एबीसी ट्रांसपोर्टर स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP, ABCG2) की murine orthologue, कम से कम चार वैकल्पिक प्रमोटरों कि इसी चार वैकल्पिक पहले एक्सॉनों उत्पादित द्वारा नामित कर रहे हैं। इस के साथ साथ, में सिलिको प्रोटोकॉल Bcrp1 के लिए वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग भविष्यवाणी करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। इसके अलावा, संवाददाता परख तरीकों वैकल्पिक प्रमोटरों के लिए रिपोर्टर निर्माणों का उत्पादन करने और वैकल्पिक पहले एक्सॉनों कि पहचान कर रहे हैं के अपस्ट्रीम ख्यात प्रमोटरों की कार्यक्षमता को निर्धारित करने के लिए वर्णित हैं।
Introduction
अधिक मानव जीन के आधे से अधिक विकल्प प्रमोटरों 1 द्वारा विनियमित रहे हैं। प्रत्येक विकल्प के प्रमोटर नियामक तत्व है कि अन्य वैकल्पिक प्रमोटरों में उन लोगों से अलग हो सकता है शामिल कर सकते हैं। प्रमोटर (एस) एक ऊतक में उपयोग किया एक और ऊतक में इस्तेमाल उन लोगों से भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, यह है कि एक दिया संकेतन मार्ग की सक्रियता का एक जीन एक ऊतक में उपयोग के लिए वैकल्पिक प्रमोटर को गति प्रदान कर सकते हैं, पर अभी तक कोई प्रभाव नहीं है या एक ही जीन है कि एक और ऊतकों में उपयोग किया जाता है के लिए एक अलग विकल्प प्रमोटर को दबाने के लिए संभव है।
Bcrp1 जीन की अभिव्यक्ति वैकल्पिक प्रमोटरों द्वारा संचालित है। Bcrp1 मानव स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP) जीन की murine orthologue है। BCRP एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर, ABCG2 2, 3 औपचारिक रूप से नामित है। एक शिखर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के रूप में, BCRP / Bcrp1 कार्यों प्राकृतिक और जीनोबायोटिक substrates की एक विस्तृत विविधता तपका <sup> 3, 4। 12 – मनुष्यों और चूहों में, BCRP / Bcrp1 अत्यधिक ऐसे जिगर (पित्त canaliculi), आंत, और गुर्दे की, साथ ही अंगों ऐसे नाल, मस्तिष्क और वृषण 2, 5 के रूप में रक्त-ऊतक बाधाओं के साथ के रूप में औषधीय प्रासंगिक अंगों में व्यक्त किया जाता है। Hematopoietic और अन्य स्टेम सेल, कैंसर स्टेम कोशिकाओं सहित, में BCRP / Bcrp1 की अभिव्यक्ति xenobiotics और कैंसर कीमोथेरेपी दवाओं 3 करने के लिए इन कोशिकाओं के प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं।
सामान्य और नवोत्पादित कोशिकाओं में BCRP अभिव्यक्ति के नियमन को समझने के लिए जल्दी काम में, 5 'सीडीएनए समाप्त होता है (5'-दौड़) BCRP mRNA के विश्लेषण के तेजी से प्रवर्धन उसका सही ट्रांसक्रिप्शनल शुरू साइट 13 निर्धारित करने के लिए किया गया था। इतना ही नहीं कई ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों पाए गए, यह भी सामना करना पड़ा पहली एक्सॉन, जो BCRP में अनुवाद नहीं किया गया है की तीन वैकल्पिक रूपों थे। इन वैकल्पिक पहले एक्सॉनों – नामित E1A, E1B, E1c – मानव ऊतकों की एक किस्म में अलग ढंग से व्यक्त किया गया। दो अतिरिक्त पहली एक्सॉन वेरिएंट BCRP 13 के दूसरे एक्सॉन का उपयोग मानव ईएसटी डेटाबेस के एक विस्फोट खोज में खोज रहे थे। चार मैचों में एक प्रथम एक्सॉन> 70 अपस्ट्रीम एक्सॉन 2 जो E1u नामित किया गया से केबी से पता चला है; चार अन्य मैचों BCRP mRNA है कि एक पहली एक्सॉन पूरी तरह से अभाव है, जो E1- 13 नामित किया गया पता चला। वैकल्पिक नेता एक्सॉनों की उपस्थिति विकल्प प्रमोटर उपयोग 14 की एक मिसाल माना जाता है।
चूहों में, चार Bcrp1 के वैकल्पिक पहले एक्सॉनों वर्णित हैं कि वैकल्पिक प्रमोटरों है कि सरकार विभिन्न माउस ऊतकों में BCRP 1 प्रतिलेखन के अनुरूप कर सकते हैं; इन एक्सॉनों / प्रमोटरों E1U, E1A, E1B और E1C नामित कर रहे हैं, और लगभग 70 स्थित हैं, Bcrp1 एक्सॉन 2 से 5, 15 से 58, 15, और 5 केबी नदी के ऊपर। E1A mRNA isoform Murin में प्रमुख होना पाया गयाई hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, हृदय, फेफड़े, तिल्ली, और मस्तिष्क, जबकि E1B isoform अस्थि मज्जा 5, 15 में माउस आंत, भ्रूण जिगर की कोशिकाओं, और erythroid अग्रदूत कोशिकाओं में व्यक्त की गई थी। नदी के ऊपर E1B से प्रमोटर, माउस आंत में Bcrp1 प्रतिलेखन गवर्निंग प्रमुख विकल्प प्रमोटर होना दिखाया गया था विनियमित कम से कम हिस्से में, phospho-चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (पी-CREB) और एक CREB प्रतिक्रिया तत्व है कि वैकल्पिक करने के लिए अद्वितीय द्वारा Bcrp1 प्रमोटर 16। E1C mRNA isoform मुख्य रूप से वयस्क murine जिगर और गुर्दे 5 में व्यक्त किया जाता है। E1U isoform सबसे murine वृषण, जहां यह प्रबल isoform 5 व्यक्त की है के लिए छोड़कर परीक्षण किया ऊतकों में undetectable है। Bcrp1 चूहे वृषण में व्यक्त (वीर्योत्पादक endothelium, जहां यह देर चरण spermatids 4 की रक्षा कर सकते में) दोनों दैहिक (endothelial तंग जंक्शनों, peritubular myoid कोशिकाओं, और Sertoli कोशिकाओं) और रोगाणु कोशिकाओं में पाया जाता है। regआयन अपस्ट्रीम E1U से steroidogenic कारक-1 (एफ -1) 5 के लिए एक कार्यात्मक प्रतिक्रिया तत्व शामिल हैं। Bcrp1 mRNA और प्रोटीन स्पष्ट रूप से Sertoli सेल विशिष्ट एस एफ -1 पीटा चूहों के वृषण में कम हो रहे हैं, सुझाव है कि murine Sertoli कोशिकाओं में Bcrp1 अभिव्यक्ति एस एफ -1 5 से नियंत्रित किया जाता है।
विस्तार के तरीकों प्रस्तुत प्रोटोकॉल में सिलिको Bcrp1 के वैकल्पिक पहले एक्सॉनों पता लगाने के लिए, और नदी के ऊपर विकल्प पहले एक्सॉनों पहचान से ख्यात प्रमोटरों के लिए luciferase आधारित रिपोर्टर assays स्थापित करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
तरीकों और प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत की बहुमत पिछले काम का हकदार है जो 2013 5 में प्रकाशित किया गया था "माउस वृषण में बी crp1 प्रतिलेखन एक उपन्यास पहली एक्सॉन (E1U) steroidogenic कारक -1 द्वारा विनियमित, नदी के ऊप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम डगलस डी रॉस और दिग्गजों मामलों के विभाग से आरिफ हुसैन को मेरिट समीक्षा पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
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