I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1

Summary

Con il murino ABC trasportatore Bcrp1 (ABCG2), come esempio, in-silico protocolli sono presentati per rilevare utilizzo promotore alternativo geni espressi in tessuti di topo, e per valutare la funzionalità dei promotori alternativi identificati mediante saggi del reporter.

Abstract

L'espressione genica in diversi tessuti è spesso controllata da promotori alternativi che risultano nella sintesi di mRNA con uniche - di solito non tradotte - primi esoni. Bcrp1 (ABCG2), il ortologo murino della ABC trasportatore Breast Cancer Resistenza Protein (BCRP, ABCG2), ha almeno quattro promotori alternativi che sono designati dai corrispondenti quattro primi esoni alternativi prodotte: E1U, E1A, E1B, e E1C. Qui, in-silico protocolli vengono presentati per prevedere l'utilizzo promotore alternativa per Bcrp1. Inoltre, metodi di analisi giornalista sono descritti per produrre costrutti reporter per promotori alternativi e per determinare la funzionalità dei promotori putativi monte dei primi esoni alternativi identificati.

Introduction

Più della metà dei geni umani sono regolati dai promotori alternativi ^1. Ogni promotore alternativa può contenere elementi regolatori che possono essere diverse da quelle degli altri promotori alternativi. Il promotore (s) utilizzato in un tessuto può differire da quelli utilizzati in un altro tessuto. Ad esempio, è possibile che l'attivazione di un dato percorso di segnalazione può attivare il promotore alternativa a un gene utilizzata in un tessuto, ma non hanno alcun effetto o reprimere un promotore alternativa separato per lo stesso gene che viene utilizzata in un altro tessuto.

L'espressione del gene Bcrp1 è govern....

Protocol

1. previsione in silico della alternativi primi esoni del Bcrp1 Usando BLAST Analisi del mouse EST database

Nota: Questo protocollo viene descritto come cercare il tag del mouse sequenza espressa (EST) del database per EST con similarità di sequenza di esone 2 di Bcrp1 (che contiene il sito di inizio traslazionale) e poi come allineare le corrispondenti sequenze EST di sequenze genomiche per accertare il loro posizione nel topo Bcrp1 gene rispetto alla estremità 5 'di Bcrp1 dell'esone 2.

1. Ottenere la sequenza per il mouse Bcrp1 esone 2 inserendo l'ID sequenza di riferimento di mRNA (NM_011920.3) nella finest....

Results

Identificazione di BCRP 1 alternativa utilizzo promotore nei testicoli del mouse attraverso l'analisi degli esoni capo

Quando il database EST a NCBI era sondato (aprile 2015) utilizzando la procedura descritta nel protocollo 1, le EST scoperto che erano contigui con 5 'dell'esone 2 in BCRP 1 mRNA sono riportati nella tabella 1, insieme con la.......

Discussion

La maggior parte dei metodi e dei risultati rappresentativi presentati sono descritti nel precedente lavoro intitolato "B crp1 trascrizione nei testicoli del mouse è controllato da un promotore a monte di un romanzo primo esone (E1U) regolato da steroidea fattore-1", che è stato pubblicato nel 2013 ⁵ . Oltre ai risultati rappresentativi raffigurati, la carta precedente fornito stime delle alternative prima utilizzazione esone usando 5'-RACE metodologia PCR e RT-PCR. Inoltre, in-sili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALI E KIT BIOLOGICI COMMERCIALI:
Kit RLM-RACE di prima scelta	Ambion Inc., Austin, TX, attualmente disponibile tramite Life Technologies	AM1700	Kit PCR 5'-RACE
Kit di clonazione TOPO TA	Life Technologies	K450001	Questo kit contiene i batteri TOP10 chimicamente competenti E. coli.
Kit di legatura rapida T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M2200
Faststart Taq- DNA polimerasi	Sigma-Aldrich/Roche	3553400001/RMB-4738284001	Contiene una miscela di enzimi polimerasi Taq ad alta fedeltà
Reagente di trasfezione del DNA XtremeGENE HP	reporter Roche	6366236001
Dual-luciferase	Promega	E1910	Include il vettore reporter vuoto pGL3-basic (luciferasi di lucciola), il vettore che esprime la luciferasi renilla pRLTK e altri vettori di controllo.
QIAprep	Qiagen	27104	Per miniprep plasmidico - isolamento e purificazione del DNA plasmidico da colonie batteriche,
vettore pCR2.1	parte del kit
basica pGL3-contenente il vettore	Promega	E1751
pRL-TK, Renilla, luciferasi che esprime il vettore	Promega	E2241
cromosoma artificiale batterico	Centro risorse BACPAC, Bambini s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA	RP23-285A12 e RP24-314E24	http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol	Life Technologies	15596026
Wizard® Sistema di pulizia SV Gel e PCR	Promega	A9281	Utile per purificare i prodotti PCR dopo la digestione con endonucleasi di restrizione
CRYOVIALS Denville	Scientific	V9012
SOFTWARE:
Ensembl software	Progetto Ensembl	http://Ensembl.org	Il progetto Ensembl produce banche dati genomiche per vertebrati e altre specie eucariotiche e rende queste informazioni disponibili gratuitamente online.
Software di sabbiatura	NCBI	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Rete & PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software	Simgene	http://simgene.com/Primer3	Utile per la progettazione di primer per 5'-RACE PCR
NCBI Database nucleotidico	NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
LINEE CELLULARI:
TM4 cellule di Sertoli murino	ATCC, Manassas, Virginia	CRL-1715&commercio;
INSTRUMENTS:
Luminometer	Turner Biosystems	TD-20/20	Questo è un luminometro relativamente economico, azionato manualmente. Sono disponibili anche sistemi automatizzati dello stesso produttore che utilizzano piastre da 96 pozzetti.
Spettrofotometri NanoDrop	Thermo Scientific, Inc.	NanoDrop 2000	può utilizzare quantità molto piccole di campione
DU 800 UV/VIS spettrofotometro e software per l'analisi degli acidi nucleici II	BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA	DU 800