Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1
Summary
Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.
Abstract
La expresión de genes en diferentes tejidos es a menudo controlado por promotores alternativos que resultan en la síntesis de ARNm con únicas – por lo general no traducidas – primeros exones. BCRP1 (Abcg2), el ortólogo murino de la mama ABC transportador de proteína de resistencia al cáncer (BCRP, ABCG2), tiene por lo menos cuatro promotores alternativos que son designados por los correspondientes cuatro primeros exones alternativos producidos: E1U, E1A, E1B, y E1C. En este documento, en silico protocolos se presentan para predecir el uso promotor alternativo para BCRP1. Además, se describen métodos de ensayo reportero para producir construcciones de reportero de promotores alternativos y para determinar la funcionalidad de los promotores putativos aguas arriba de los primeros exones alternativos que se identifican.
Introduction
Más de la mitad de los genes humanos están regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativo puede contener elementos reguladores que pueden ser diferentes de los de otros promotores alternativos. El promotor (s) utilizado en un tejido puede diferir de los utilizados en otro tejido. Por ejemplo, es posible que la activación de una vía de señalización dado puede desencadenar el promotor alternativo para un gen utilizado en un tejido, sin embargo, no tienen efecto sobre o reprimir un promotor alternativo separado para el mismo gen que se utiliza en otro tejido.
La expresión del gen BCRP1 se rige por los promotores alternativos. BCRP1 es el ortólogo murino del gen humano de mama proteína de resistencia al cáncer (BCRP). BCRP es un transportador de casete de unión a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como una proteína de la membrana plasmática apical, funciones BCRP / BCRP1 de flujo de salida de una amplia variedad de sustratos naturales y xenobióticos <sup> 3, 4. En los seres humanos y los ratones, BCRP / BCRP1 es altamente expresado en órganos farmacológicamente relevantes, tales como el hígado (canalículos biliares), intestino y riñón, así como los órganos con las barreras de los tejidos de la sangre, tales como placenta, cerebro y testículo 2, 5-12. Expresión de BCRP / BCRP1 en hematopoyéticas y otras células madre, incluyendo células madre del cáncer, puede conferir resistencia de estas células a xenobióticos y fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer 3.
A principios de trabajo para entender la regulación de la expresión de BCRP en células normales y neoplásicas, se realizó 5 'rápida amplificación de cDNA extremos (5'-RACE) análisis de ARNm de BCRP para determinar su sitio de inicio de la transcripción exacta 13. No sólo eran múltiples sitios de inicio de la transcripción que se encuentran; También se encontraron tres formas alternativas del primer exón, que a su BCRP es sin traducir. Estos primeros exones alternativos – designados E1a, E1b, E1c – se expresaron de manera diferente en una variedad de tejidos humanos. Dos variantes adicionales primer exón fueron descubiertos en una búsqueda BLAST de la base de datos de EST humano utilizando el segundo exón del BCRP 13. Cuatro partidos revelaron una primera exón> 70 kb aguas arriba del exón 2 que fueron designados E1U; otros cuatro partidos reveló ARNm de BCRP que carecía de un primer exón del todo, que fueron designados E1- 13. La presencia de exones líder alternativos se considera que es una manifestación del uso promotor alternativo 14.
En ratones, cuatro exones primera alternativa de BCRP1 se describen que pueden corresponder a otros promotores que regulan la transcripción BCRP 1 en diferentes tejidos de ratón; estos exones / promotores se designan E1U, E1A, E1B y E1C, y se encuentran a unos 70, 58, 15 y 5 kb aguas arriba del exón 2 BCRP1 5, 15. Se encontró que la isoforma E1A ARNm ser predominante en Murine las células madre hematopoyéticas, corazón, pulmón, bazo y cerebro, mientras que la isoforma E1B se expresó en intestino de ratón, células de hígado fetal, y las células precursoras eritroides en la médula ósea 5, 15. El promotor aguas arriba de E1B ha demostrado ser el principal promotor alternativo de gobierno BCRP1 transcripción en intestino de ratón, regulada al menos en parte, por-cíclico-fosfo AMP proteína elemento de respuesta de unión (p-CREB) y un elemento de respuesta CREB única para esa alternativa promotor BCRP1 16. La isoforma E1C mRNA se expresa predominantemente en el hígado murino adulto y riñón 5. La isoforma E1U es indetectable en la mayoría de los tejidos a prueba a excepción de testículo murino, donde es la isoforma predominante expresado 5. BCRP1 expresa en los testículos de ratas se encuentra en ambas uniones endoteliales (células cerradas, myoid peritubulares y células de Sertoli) somáticas y las células germinales (en el endotelio seminíferos, donde se puede proteger espermátidas la última etapa 4). el region aguas arriba de E1U contiene un elemento de respuesta funcional para steroidogenic factor 1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm y proteínas se reducen notablemente en los testículos de SF-1 knockout mice específicos de células de Sertoli, lo que sugiere que la expresión BCRP1 en células de Sertoli murinas se controla mediante SF-1 5.
Los protocolos presentados detalle métodos para detectar exones primera alternativa de BCRP1 en silico, y establecer reportero ensayos basados en la luciferasa para supuestos promotores aguas arriba de los primeros exones alternativos identificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayoría de los métodos y resultados representativos presentados se describen en el trabajo anterior titulado "B CRP1 la transcripción en los testículos del ratón es controlado por un promotor aguas arriba de un nuevo primer exón (E1U) regulada por el factor 1 de esteroides, a la" que fue publicado en 2013 5 . Además de los resultados representativos representados aquí, en el documento anterior proporciona estimaciones de primera utilización exón alternativo utilizando 5'-RA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas por mérito de revisión a Douglas D. Ross y a Arif Hussain, del Departamento de Asuntos de Veteranos.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Riferimenti
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
