Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d'analyser motilité gastro-intestinale chez la souris
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Le système nerveux entérique (ENS) joue un rôle important dans la régulation gastro-intestinal (GI), la motilité et peut fonctionner indépendamment du système nerveux central. Changements dans la fonction ENS sont une cause majeure de symptômes gastro-intestinaux et les maladies et peuvent contribuer à des symptômes gastro-intestinaux signalés dans les troubles neuropsychiatriques, y compris l'autisme. Il est bien établi que les segments isolés du côlon génèrent, contractions rythmiques spontanées appelées colique Migration Motor Complexes (CMMCs). Une procédure pour analyser la régulation neurale entérique des CMMCs en ex vivo de préparations colon de la souris est décrite. Le côlon est disséqué de l'animal et rincée pour enlever le contenu fécale avant d'être une canule dans un bain d'organe. Les données sont acquises par une caméra vidéo placée au-dessus du bain d'organe et converti en cartes spatio-temporelles à haute résolution via un logiciel interne. Grâce à cette technique, les modes de contraction de base et les effets pharmacologiques sur la fonction ENS en colon segments peuvent être comparés sur 3-4 heures. En outre, la durée de propagation et la vitesse de CMMCs peuvent être enregistrées ainsi que les changements de diamètre de l'intestin et de la fréquence de contraction. Cette technique est utile pour déterminer les caractéristiques de la motilité gastro-intestinaux chez des modèles de souris transgéniques (et dans d'autres espèces, y compris le rat et le cochon Guinée). De cette manière, les changements induits dans pharmacologiquement CMMCs sont enregistrées chez les souris de type sauvage et dans le modèle de l'autisme R451C Neuroligin-3 de la souris. En outre, cette technique peut être appliquée à d'autres régions du tractus gastro-intestinal y compris le duodénum, le jéjunum et l'iléon et à différents âges de développement chez la souris.
Introduction
Le système nerveux entérique (ENS) est le réseau neuronal intrinsèque du tractus gastro-intestinal et module diverses fonctions telles que la digestion du contenu intestinal, l'absorption de nutriments et la sécrétion et la réabsorption d'eau. Les neurones de l'ENS sont situés dans les myentériques et la sous-muqueuse plexus. Le plexus myentérique joue un rôle majeur dans la régulation de la motilité gastro-intestinale 1 alors que le plexus sous-muqueux est principalement impliquée dans le contrôle de la sécrétion 2,3. Le plexus myentérique est située entre les couches musculaires longitudinales et circulaires de la paroi gastro-intestinale. L'activité contractile des couches de muscles lisses de la paroi intestinale facilite les fonctions principales du tractus gastro-intestinal et en mélangeant le contenu intestinal propulsion sur toute la longueur de l'intestin 3. Bien que l'innervation extrinsèque au tractus gastro-intestinal du CNS contribue à la fonction gastro-intestinale in vivo, L'ENS est capable de réguler la fonction gastro-intestinale indépendamment. Cette caractéristique unique permet à l'exploration fonctionnelle des circuits neuronaux entériques et leur contribution à la motilité gastro-intestinale ex vivo.
Les complexes du côlon qui migrent à moteur (CMMCs) sont des événements spontanés neurogènes qui sont le motif du moteur prédominant observé dans le côlon de souris isolé en l'absence de boulettes fécales 4-9. CMMCs sont définis comme des contractions rythmiques qui se propagent sur une distance horizontale qui est au moins la moitié de la longueur totale du côlon (par exemple, à partir du caecum au rectum) 10. La relation entre CMMCs et les motifs contractiles qui propulsent pelotes fécales est pas encore clairement établie, cependant quelques différences pharmacologiques ont été signalés 11. Néanmoins, la capacité de l'ENS de fonctionner indépendamment du système nerveux central ainsi que l'existence de motifs de neurones moteurs à médiation dans le SIcôlon olated fournit un système de dosage idéal pour étudier des troubles de la motilité résultant d'un dysfonctionnement ENS sous-jacent. La spontanéité de la motricité gastro-intestinaux fonctionnels permet des changements en réponse à des stimuli pharmacologiques pour être évalués.
L'utilisation de l'imagerie vidéo et la cartographie spatio-temporelle a été développé afin d'examiner quantitativement faible péristaltisme intestinal chez des cobayes 12. Ici, une technique ex vivo est décrite qui permet l'étude des schémas de la motilité du côlon de souris en utilisant l'imagerie et l'analyse de ces enregistrements vidéo sur la construction à haute résolution (~ 100 um, de 33 msec) des cartes du diamètre du côlon en fonction de la position le long du côlon et de temps (cartes spatio-temporelles). En utilisant un logiciel interne de détection de bord (Analyse2; disponible sur demande), les données de pleine longueur segments coliques contractantes en temps réel sont traitées pour générer des cartes spatio-temporelles pour chaque expérience. Dans cette étape, vidéo (AVI) sont summarisée et convertis en cartes spatio-temporelles en utilisant Analyse2. Cartes spatio-temporelles (figure 2) représentent la contractilité dans le temps et permettent la mesure de plusieurs paramètres, dont la vitesse de propagation, l'ampleur, la durée et la durée. diamètre de l'intestin est également enregistrée pendant toute la durée de l'expérience en tant que mesure de la contractilité globale du segment de tissu. Cette méthode peut être appliquée pour identifier les différences de point d'initiation de complexes contractiles qui pourrait indiquer altérée connectivité neurale entérique.
Un protocole d'imagerie vidéo similaire conçu pour évaluer culot propulsion chez le cobaye a été rapporté 13 mais ici, nous présentons l'application de l'approche d'imagerie vidéo pour la quantification de la motilité colique spontanée (ie, en l'absence de pellets). Nous fournissons également des informations détaillées pour aider à la dissection et la préparation de tissu gastro-intestinal de l'approche d'imagerie vidéo. Ceprotocole fournit aux chercheurs un outil accessible et facile à reproduire pour l'analyse de contrôle neural entérique de la fonction gastro-intestinale chez des modèles animaux de la maladie, y compris les modèles génétiques de souris.
La technique d'imagerie vidéo permet l'analyse de la motricité colique en réponse à divers agents pharmacologiques. Les médicaments peuvent être administrés par l'intermédiaire de la lumière intestinale ou du bain d'organes externes de la préparation du côlon. Différentes régions du tractus gastro-intestinal de souris présentent des schémas de la motilité spécifiques tels que les petits segmentation CMMCs intestinal et dans le côlon.
Cette technique a été utilisée pour identifier les différences de contrainte en petite fonction intestinale; la sensibilité différentielle pour 5-HT3 et 5-HT4 antagonistes ont été observés dans le jéjunum de Balb / c et des souris C57 / BL6 en raison de la nature polymorphique du gène TPH2 exprimée dans les deux souches 6. L'effet de la 5-HT inhibition sur la motilité reste concontroversée, car les données contradictoires a été rapporté sur l'importance d'un développement endogène 5-HT sur le péristaltisme du côlon et CMMCs 14,15. Modifications de la motilité avant et pendant le développement postnatal 7, ainsi que les effets de mutations géniques sur motilité gastro-intestinale chez des modèles animaux de maladie 10 peuvent également être examinés par imagerie en utilisant vidéo. Ici, nous illustrons l'utilisation du procédé à une étude de la motilité du côlon dans le modèle de souris NL3 R451C de l'autisme, qui exprime une mutation faux-sens dans le gène codant pour la protéine NLGN3 d'adhérence synaptique Neuroligin 3-16. Cette mutation a été identifiée pour la première chez les patients diagnostiqués avec un trouble du spectre autistique (TSA) 17, qui est fortement associée à un dysfonctionnement de GI 18-22. Nous avons examiné si la mutation R451C synaptique NL3 affecte sorties de neurones dans l'ENS en utilisant la technique d'imagerie vidéo. Nous présentons des données caractérisant CMMCs au départ et en réponse à la 5H sérotoninergiqueT 3/4 antagoniste du récepteur tropisétron dans le modèle de souris NL3 R451C de l'autisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant cette technique d'imagerie vidéo, la fréquence CMMC a été mesurée comme une indication de la motilité du côlon dans le type sauvage et les souris NL3 R451C, un modèle de souris de troubles du spectre autistique 17. Nos résultats indiquent une réduction du nombre de CMMCs chez les souris mutantes NL3 R451C par rapport aux souris de type sauvage en présence de l'antagoniste du récepteur 5-HT 04/03 Tropisetron suggérant que les souris NL3 R4…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB et ELH-Y ont été pris en charge par le ministère américain du programme de recherche sur l'autisme CDMRP Défense (AR11034). NHMRC (1047674) à ELH-Y.Procédé mai Stewart Bourse-Université de confiance Melbourne financé bourse pour MS. Nous remercions Ali Taher, Fátima Ramalhosa et Gracia Seger des contributions techniques.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Riferimenti
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
