La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell'occhio composto di una farfalla.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti
In questo articolo
Sommario
Abstract
registrazione intracellulare è una tecnica potente usato per determinare come una singola cellula può rispondere ad un dato stimolo. Nella ricerca visione, la registrazione intracellulare è stata storicamente una tecnica comune usata per studiare la sensibilità di cellule visive individuali a diversi stimoli luminosi che è ancora in uso oggi. Tuttavia, rimane una carenza di metodologia dettagliata nella letteratura per i ricercatori che desiderano replicare gli esperimenti di registrazione intracellulare negli occhi. Qui vi presentiamo l'insetto come modello per l'esame fisiologia dell'occhio, più in generale. fotorecettori insetti si trovano vicino alla superficie dell'occhio e sono quindi facilmente raggiungibili, e molti dei meccanismi coinvolti nella visione si conservano tutta phyla animali. Descriviamo la procedura di base per la registrazione in vivo intracellulare di cellule visive negli occhi di una farfalla, con l'obiettivo di rendere questa tecnica più accessibile ai ricercatori con poca esperienza precedente in electrophysiology. Introduciamo l'attrezzatura di base, come preparare una farfalla reale per la registrazione, come inserire un microelettrodo di vetro in una singola cella, e infine la procedura di registrazione stessa. Spieghiamo anche l'analisi di base dei dati di risposta prime per determinare la sensibilità spettrale di tipi di cellule individuali. Sebbene il protocollo concentra sulla determinazione sensibilità spettrale, altri stimoli (ad esempio, la luce polarizzata) e variazioni del metodo sono applicabili a questa configurazione.
Introduzione
Le proprietà elettriche delle cellule come i neuroni si osservano misurando il flusso di ioni attraverso le membrane cellulari come un cambiamento di tensione o corrente. Una varietà di tecniche elettrofisiologiche sono state sviluppate per misurare eventi bioelettrici nelle cellule. I neuroni trovati nelle occhi degli animali sono accessibili e loro circuiti è spesso meno complesso nel cervello, rendendo queste cellule buoni candidati per lo studio elettrofisiologico. Le applicazioni più comuni di elettrofisiologia negli occhi includono elettroretinografia (ERG) 1,2 e microelettrodi registrazione intracellulare. ERG prevede il posizionamento di un elettro....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli animali sono stati trattati come umanamente possibile. Gli insetti sono stati spediti come pupe da Costa Rica entomologica di alimentazione, Costa Rica.
1. Heliconius Pupe Cura
- Hang tutto pupe distanziati di 2-3 cm di distanza in una camera umidificata con perni di insetti.
- Dopo eclosion, consentono ali per asciugare poi mantenere le farfalle in vita per almeno 1 giorno in una camera umidificata e alimentano una soluzione diluita di miele al giorno prima della registrazione.
- Diluire il miele con acqua fino a circa una soluzione di miele 20% in volume, e versare in un piatto fondo di Petri.
- Portare sin....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per molti elementi della configurazione di registrazione, una descrizione scritta non fornisce dettagli sufficienti. Figura 1 è una schematica dei componenti coinvolti nella configurazione registrazione completa. In figura 2, spettri sono tracciate per luce bianca e ciascun filtro di interferenza a dare un senso del perché è necessario un fattore di correzione e ciò che è necessario per calcolare la correzione. La Figura 3 mostra foto e un diagramma del braccio.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
registrazione intracellulare può essere una tecnica difficile da padroneggiare a causa dei molti passaggi tecnici coinvolti. Per gli esperimenti di successo devono essere considerati diversi punti importanti. In primo luogo, è importante avere una tabella correttamente vibrazionalmente-isolato su cui viene eseguita l'esperimento. Molti ricercatori utilizzano le tabelle d'aria, che separano completamente il tavolo dalla base, dando isolamento dalle vibrazioni superiori. La nostra messa a punto prevede un tavolo d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il ritardo Rudy Limburgo per fabbricare le perimetro del braccio cardanici, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate per averci prestato attrezzature, e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, per incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship per KJM e Grant NSF IOS-1.257.627 a ADB
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Diverse | specie locali disponibili, necessitano di permessi USDA per la spedizione. Carolina Bio Supply ha diverse specie di insetti che possono essere ordinate negli Stati Uniti senza la necessità di ulteriori permessi Grande | ||
| cilindro | Qualsiasi camera che rimane umidificata funzionerà | ||
| Perni per insetti, misura 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey Trader | Joe's | Qualsiasi soluzione di miele o saccarosio funzionerà | |
| Xenon Arc | Lamp Oriel Instruments | 66003 | Oriel fa ora parte di Newport Corporation |
| Universal Power | Supply Oriel Instruments | 68805 | Oriel fa ora parte di Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel fa ora parte di Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel fa ora parte di Newport Corporation |
| Rail Carrier, piccolo (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel fa ora parte di Newport Corporation |
| Adattatore filettato, da 8-32 maschio a 1/4-20 maschio, confezione da 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Perno di montaggio ottico, 1,0 pollici, 0,5 pollici Ø inossidabile, 8-32 e 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| per perno ottico antiscivolo, 2 pollici, 0,5 pollici. Diametro perni, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Attacco obiettivo fisso, 50,8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Attacco obiettivo fisso, 25,4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Gruppo obiettivo condensatore | Newport Corporation | 60006 | |
| Lente convessa in silice, 50,8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Ruota portafiltri a sei posizioni, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Mozzo per montaggio su ruota portafiltri | Newport Corporation | FWM | |
| Lente concava in silice, 25,4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Supporto collimatore | Newport Corporation | 77612 | |
| Sonda a fascio di collimazione | Newport Corporation | 77644 | |
| Convertitore a ghiera, terminazione SMA a ghiera standard da 11 mm | Newport Corporation | 77670 | Questo adattatore consente alla fibra ottica di inserirsi nel supporto del collimatore |
| 600 μ m diametro cavo obtico in fibra UV-vis | Oriel Instruments | 78367 | Oriel è ora una parte di Newport Corporation |
| Otturatore con unità di azionamento | Uniblitz | 100-2B | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| Filtro ND metallico in silice fusa UV, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lampada | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Filtro passa-banda di interferenza, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Filtro passa-banda di interferenza, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| di Faraday | Funzionerà qualsiasi struttura metallica che possa essere collegata a terra e che si adatti alla configurazione sperimentale. | ||
| Stereomicroscopio, ingrandimento 6X, 12X, 25X, 50X | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Qualsiasi stereomicroscopio andrà bene |
| Supporto per microscopio con braccio oscillante e base pesante | Strumenti | Qualsiasi base pesante con braccio farà | |
| braccio | Costruito su misura, Vedi Figura 4 | ||
| Illuminatore ad alta intensità Fiber-lite | Dolan-Jenner | MI-150 | Per l'esempio di illuminazione |
| Guida luminosa a collo d'oca in fibra ottica | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Qualsiasi guida luminosa a collo d'oca andrà bene |
| Tavolo | |||
| Tavolo | Il foro deve essere tagliato attraverso questo tavolo in modo che la sabbiera possa poggiare sul tavolo in marmo sottostante | ||
| Scatola di legno riempita di sabbia | costruita su misura, qualsiasi scatola con sabbia | ||
| Manipolatore | Carl Zeiss - Jena | ||
| Portaelettrodo | |||
| Stadio | |||
| Fili a coccodrillo per la messa a | |||
| Filo | |||
| Filo d'argento, diametro 0,125 mm | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| cavi | BNC | ||
| Preamplificatore con headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Riduttore di rumore Humbug | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscopio, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, senza sonda | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Software Labchart | Strumenti ADI | Chart 5 | |
| impulsi da 10 MHz | BK Precision | 4030 | |
| Estrattore per pipette in vetro | Sutter Instruments | P-87 | |
| Capillari in vetro borosillicato con filamento | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Cloruro di potassio, 3 M | |||
| di plastica scanalato | |||
| Cera | |||
| Saldatore | Weller | ||
| Piattaforma con base magnetica a sfera e presa | Hama foto e video | ||
| acciaio al carbonio a doppio taglio, lama di rasoio fragile | Scienze al microscopio elettronico | 72004 | |
| Vaselina | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
Riferimenti
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
