Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.
Glaukom är en sjukdom i det centrala nervsystemet som drabbar retinala ganglieceller (RGC: er). RGC axoner som bildar synnerven bär visuell input till hjärnan för visuell perception. Skador på RGC och deras axoner leder till synförlust och / eller blindhet. Även om den specifika orsaken till glaukom är okänd, är den primära riskfaktorn för sjukdomen ett förhöjt intraokulärt tryck. Glaukom framkallande förfaranden i djurmodeller är ett värdefullt verktyg för forskare som studerar mekanismen för RGC död. Sådan information kan leda till utveckling av effektiva nervskyddande behandlingar som kan hjälpa till att förebygga synnedsättning. Protokollet i detta dokument beskriver en metod för att inducera glaukom – lika förhållanden i en in vivo råttmodell där 50 pl 2 M hyperton saltlösning sprutas in i episklerala venösa plexus. Blanche av fartygen indikerar lyckad injektion. Denna procedur orsakar förlust av RGC att simulera glaukom. En månad efterinjektion avlivas djuren och ögonen avlägsnas. Därefter hornhinnan, linsen och glaskroppen bort för att göra en ögonmusslan. Näthinnan är sedan dras av från bakre delen av ögat och nålas på Sylgard rätter med kaktus nålar. Vid denna punkt, kan nervceller i näthinnan färgas för analys. Resultat från denna laboration visar att cirka 25% av RGC försvinner inom en månad efter det förfarande jämfört med den interna kontrollen. Detta förfarande möjliggör kvantitativ analys av retinal ganglion celldöd i en in vivo rått glaukom modell.
Glaukom är en grupp av ögonsjukdomar som påverkar neuroner i näthinnan, specifikt, de retinala ganglionceller 1-2. Axonerna hos dessa celler konvergerar till att bli synnerven som bär visuell information till hjärnan där sikten är uppfattas. Skador på RGC och deras axoner orsakar därför synfel.
De primära egenskaper som förknippas med glaukom störningar är RGC degeneration och död, förhöjt intraokulärt tryck (lOP) och synnervspapillen cupping och atrofi. Dessa funktioner leder till synfältsbortfall eller fullständig, irreversibel blindhet. För närvarande har glaukom orsakas blindhet i 70 miljoner människor i världen 3. Som sådan, är det världens tredje största orsaken till blindhet 4.
Den exakta mekanismen för RGC död i glaukom förblir okänd. Mycket forskning har gjorts för att låsa upp mysteriet. Det är emellertid känt, att den primära riskfaktorn för glaukom är en ökning in intraokulära trycket på grund av oregelbunden spridning av kammarvatten (AH) i den främre ögonkammaren. AH fungerar som en transparent och färglös ersättning för blod i avaskulära främre ögonkammaren. Det ger näring de omgivande cellerna, avlägsnar utsöndrade restprodukter från metaboliska processer, transporter neurotransmittorer och möjliggör cirkulationen av läkemedel och inflammatoriska celler i ögat under patologiska tillstånd 1.
Upprätthållandet av kammarvatten cirkulation involverar ciliarkroppen och det trabekulära nätverket. Vattenhaltig humor produceras av ciliarkroppen. Den flyter sedan in i den främre kammaren för att upprätthålla den allmänna hälsan hos den okulära vävnaden. 75-80% av kammarvatten utflöde utsöndras aktivt genom icke-pigment ciliära epitelet när fluiden filtreras genom tre skikt av svampliknande vävnad i ciliarmuskeln. Fluid går ut genom det trabekulära nätverket och genom Schlemms kanal som gripatalet in i blodsystemet 5 .Det återstående 20 – 25% av utflödet kringgår det trabekulära nätverket och är passivt utsöndras av ultrafiltrering och diffusion genom uveo-skleral reaktionsvägen. Denna väg synes vara relativt oberoende av det intraokulära trycket 1.
När kammarvatten produktionen och utflödet är i obalans, byggs tryck i ögat. Såsom angivits, är denna ökning av det intraokulära trycket den primära riskfaktorn för utvecklingen av glaukom. Sådant tryck orsakar skador på de intrikata lager av neuroner i näthinnan vid baksidan av ögat. Skador på de retinala ganglion cell axoner av synnerven orsakar hjärnan att inte längre ta emot korrekt visuell information. Som ett resultat, är uppfattningen av sikt förlorad och fullständig blindhet kan förekomma.
Hittills finns det inget botemedel mot glaukom. Olika behandlingsmetoder finns som i första hand syftar till att minska det intraokulära trycket. Dessa inkluderar topiskmedicinering klasser såsom beta1-adrenerga receptorblockerare, eller utvärtes prostaglandinanaloger. Betablockerare minskar det intraokulära trycket genom att minska produktionen av kammarvatten 7. Prostaglandiner fungerar för att minska det intraokulära trycket genom att öka utflödet av kammarvatten 8-14. Alfa-adrenergiska agonister och kolsyraanhydrasinhibitorer används också som sekundära behandlingsmetoder. Alpha adrenerga agonister ökar utflödet genom uveosklerala vägen 15-17. Karbanhydrashämmare minska produktionen av AH genom enzymatisk inhibition 18. Mycket mer invasiva procedurer används också för att behandla glaukom. Laser trabeculoplasty används för att öka utflödet av kammarvatten 19. En annan kirurgisk behandling, kallad trabekulektomi skapar en alternativ plats dränering för att filtrera AH när den traditionella trabekulärt vägen är blockerad 20-21.
Dessa behandlingar har varit kända för att effektivt reducera lOP. Men upp till 40% av glaukompatienter visar normala IOP nivåer som indikerar ett behov av mer kompletta terapeutiska metoder. 22,23 Dessutom är irreversibel retinal ganglion celldöd ses i glaukom när den börjar och nuvarande behandlingar inte stoppa utvecklingen av sjukdomen 24-28. Detta har belyst behovet av effektiva neuroprotektiva terapier som riktar sig mot överlevnaden av nervceller själva. Utveckling av glaukom modeller är avgörande för denna utveckling.
I denna studie visar vi en metod för att inducera glaukom liknande effekter hos vuxna Long Evans-råttor med användning av ett modifierat förfarande som ursprungligen beskrivs av Morrison 29. I detta förfarande, injektioner av 2 M hyperton saltlösning i den episklerala venus plexus inducerar glaukomliknande tillstånd genom ärrbildning vävnad för att minska kammarvattenutflöde i det trabekulära nätverket vilket leder till en ökning i intraokulärt tryck och en betydande förlust av RGC wnom en månad av förfarandet 30-31. Glaukom framkallande förfaranden, såsom den som beskrivs här, kan vara nyckeln till ny utveckling inom glaukombehandlingar.
Detta protokoll beskriver en metod för att inducera glaukom liknande förhållanden i en in vivo råttmodell. Denna procedur använder en injektion av hyperton saltlösning för att inducera ärrbildning i det trabekulära nätverket 29, 32. Utveckling av ärrvävnad ockluderar utflödet av kammarvatten, vilket ökar trycket i den främre kammaren. Med minskad utflöde och tryck bygga upp, linsen upphängd med elastiska ligament skjuter tillbaka in i glaskroppen kammaren. Glaskroppen gäller sedan t…
The authors have nothing to disclose.
C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 mL bottle |
Acepromazine Maleate, 10mg/mL | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 mL bottle |
Serum bottle, 10 mL | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
1 mL insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 gauge needle |
Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 mL sterile bottle |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Scalpel blade # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 mL graduations |
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Cactus Needles | N/A | N/A | |
Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
Triton X-100 | Sigma | T9284-100 mL | Made into both a 1% and 0.1% solution |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
Microscope Slides | Corning | 2948-75×25 | |
Glycerol | Sigma | G5516-100 mL | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |