Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
Avec l'avènement des -omiques approches notre compréhension des maladies chroniques comme le cancer et le syndrome métabolique est améliorée. Cependant, l'exploitation minière efficace de l'information dans les ensembles de données à grande échelle qui sont obtenus à partir des microarrays d'expression des gènes, des expériences de séquençage profondes ou le profilage métabolique est indispensable pour découvrir et cibler efficacement les régulateurs critiques de phénotypes cellulaires malades. Estrogen Receptor α (ERa) est l'un des facteurs de transcription maître régissant les programmes de gènes qui sont importants pour les cancers du sein sensibles aux œstrogènes. Afin de comprendre au rôle du ERa de signalisation dans le métabolisme du cancer du sein, nous avons utilisé des données transcriptomiques, cistromic et métabolomique de MCF-7 cellules traitées avec l'estradiol. Dans ce rapport, nous avons décrit la génération d'échantillons pour l'ARN-Seq, ChIP-Seq et expériences de métabolomique et l'analyse informatique intégrative des données obtenues. Cette approche est utile pour délimiter roman taupemécanismes culaire et circuits de gènes de régulation qui sont réglementés par un facteur de transcription particulier qui a une incidence métabolisme des cellules normales ou malades.
Introduction
Les estrogènes sont des régulateurs importants de nombreux processus physiologiques chez les femmes et les hommes , y compris les tissus reproducteurs, les tissus métaboliques, le cerveau et les os 1. En plus des effets bénéfiques dans ces tissus, les œstrogènes conduisent aussi des cancers qui découlent de mammaires et les tissus reproducteurs. Les estrogènes travaillent principalement par RÉ pour induire des effets spécifiques de type cellulaire. séquençage profond des transcrits régulés par ERa en utilisant l'ADN ERa analyse des sites de liaison ARN-Seq et l'ensemble du génome en utilisant ChIP-Seq avéré être utile de comprendre comment fonctionne ERa dans différents tissus et les cancers qui en découlent. Nous et d' autres ont publié des profils de gènes d'expression associés aux différents récepteurs (ERa vs ERß) 2,3, différents ligands 3-5 et différents corégulateurs 2,4,6,7.
ARN-Seq est la principale méthode pour examiner le transcriptome, offrant une précision et une plus grande efficacité par rapport à ba microarraygène sed analyse de l' expression 8. ARN obtenu à partir des lignées cellulaires 2-4,7, des tissus ou des échantillons de tumeur sont séquences, mis en correspondance avec les ensembles génomiques disponibles et les gènes régulés de manière différentielle sont identifiés. Immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est utilisé pour disséquer le facteur de transcription et de co-régulateur se liant à des sites de liaison connus de régulation de la chromatine. ChIP-Seq (ChIP suivi par séquençage à haut débit) fournit une détection impartiale des sites de liaison mondiaux. La métabolomique est une autre approche de la biologie des systèmes de plus en plus utilisé, ce qui quantitativement les mesures, la réponse multiparamétrique dynamique des systèmes vivants à divers stimuli, y compris les produits chimiques et les perturbations génétiques.
En effectuant le profilage métabolique global, une lecture fonctionnelle peut être obtenue à partir de cellules, les tissus et le sang. En outre, des informations à partir d'expériences de transcriptome ne reflètent pas toujours les changements réels dans le niveau des enzymes qui contribuent à des voies biochimiques. Combinéanalyse des données de transcriptome et métabolome nous permet d'identifier et de corréler les changements dans l'expression des gènes avec des changements de métabolites réels. Exploiter l'information de tous ces grands ensembles de données à grande échelle fournissent les détails mécanistiques pour comprendre le rôle des facteurs de transcription régulant les systèmes biologiques complexes, en particulier ceux qui ont trait au développement humain et des maladies comme le cancer et le diabète.
La nature complexe du génome de mammifère, il est difficile d'intégrer et pleinement interpréter les données obtenues à partir des expériences transcriptomiques, cistrome et métabolome. L'identification des événements de liaison fonctionnels qui conduisent à des changements dans l'expression des gènes cibles est important parce que les sites de liaison une fois fonctionnels sont identifiés; qui a suivi l'analyse, y compris la liaison transcription (TF) analyse de motif, pourrait être réalisée avec une plus grande précision. Cela conduit à l'identification des cascades et des mécanismes de TF biologiquement significatives. comparis Aussi directssur des expériences d'ARN-Seq et ChIP-Seq ne sont pas toujours possible, car les données de chaque expérience ont différentes échelles et des bruits et dans certains cas des signaux significatifs sont obscurcis par le bruit de la population. Nous ne sommes pas au courant d'aucune étude qui a intégré les informations de ces trois approches distinctes, mais pour comprendre la régulation métabolique directe par ERa dans le cancer du sein. Par conséquent, notre objectif global de cet article est de rapporter des événements de liaison productifs à l'expression des gènes et des changements de métabolites. Afin d'atteindre cet objectif, nous avons intégré des données à partir d'ARN-Seq, ChIP-Seq et métabolomique expériences et identifié les œstrogènes induite ERa événements qui conduirait à des changements d'expression des gènes dans les voies métaboliques de liaison. Pour la première fois, nous fournissons un ensemble complet de protocoles (figure 1) pour générer ChIP-Seq, ARN-Seq et métabolomique profilage et effectuer une analyse intégrative des données pour découvrir de nouveaux circuits de gènes régulant le métabolisme du cancer du seindes lignées cellulaires de cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons décrit la génération et l'analyse intégrative de l'ARN-Seq, ChIP-Seq et les données de métabolomique de cellules MCF-7 qui sont traités avec E2. Nous avons développé un ensemble de protocoles d'élaboration de stratégies à utiliser les méthodes les plus efficaces et les utilisateurs marchandises douce amicales qui produisent la découverte biologiquement pertinente. À notre connaissance, la nôtre est la première étude à intégrer -omique les données de trois dif…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national de l'alimentation et de l'agriculture, US Department of Agriculture, récompense ILLU-698-909 (ZME) et Pfizer, Inc (ZME). Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles du Département américain de l'Agriculture.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
Riferimenti
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