Questo manoscritto descrive un protocollo semplice e riproducibile per l'isolamento delle arteriole intracerebrali (un gruppo di vasi sanguigni che comprende arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari) dai topi, da utilizzare in miografia a pressione, immunofluorescenza, biochimica e studi molecolari.
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Articolo metodologico
Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole
In questo articolo
Sommario
Abstract
arteriole parenchimali intracerebrali (AP), che comprendono arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari, sono i vasi sanguigni ad alta resistenza si ramificano fuori dalle arterie piale e arteriole e le immersioni nel parenchima cerebrale. Individuale PA defluire in un territorio cilindrica discreta del parenchima e neuroni contenuti all'interno. Questi sono arteriole un ruolo centrale nella regolazione del flusso ematico cerebrale sia a livello globale (autoregolazione cerebrovascolare) e locale (iperemia funzionale). PAs sono parte dell'unità neurovascolare, una struttura che corrisponde flusso sanguigno regionale per attività metabolica nel cervello e comprende anche neuroni, interneuroni e astrociti. Perfusione attraverso PA è direttamente collegato con l'attività dei neuroni in quel particolare territorio e gli aumenti di portare il metabolismo neuronale ad un aumento della perfusione locale causata dalla dilatazione del feed PA. Regolamento dei PA differisce da quello di meglio caratterizzatoarterie piali. vasocostrizione pressione indotta è maggiore in PA e meccanismi vasodilatatori variano. Inoltre, PA non ricevono innervazione estrinseca dai nervi perivascolari - innervazione è intrinseca ed indiretta in natura attraverso il contatto con endfeet astrociti. Così, i dati riguardanti il regolamento contrattile accumulati da studi che utilizzano arterie piali non direttamente traducono per comprendere la funzione PA. Inoltre, rimane indeterminata come stati patologici, quali ipertensione e diabete, influiscono struttura PA e reattività. Questo gap di conoscenza è in parte una conseguenza delle difficoltà tecniche relative all'isolamento PA e cannulazione. In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'incannulamento della PA roditori. Inoltre, mostriamo esempi di esperimenti che possono essere eseguite con queste arteriole, tra costrizione agonisti indotta e reattività miogenico. Anche se il focus di questo manoscritto è in PA incannulazione e myography pressione, isolato PAs può essere utilizzato anche per studi biochimici, biofisici, molecolari, e di imaging.
Introduzione
La circolazione cerebrale è organizzata unicamente per supportare le richieste metaboliche dei neuroni centrali, le cellule che hanno limitato riserve di energia e di conseguenza sono molto sensibili alle variazioni di pressione di ossigeno e di sostanze nutritive necessarie. Come particolari sottopopolazioni neuronali diventa attivo quando vengono eseguite attività specifiche, la vascolarizzazione promuove un aumento altamente localizzato in perfusione per prevenire ipossia locale, e l'esaurimento delle sostanze nutritive 1. Questa è una forma di iperemia funzionale noto come accoppiamento neurovascolare, e dipende dal corretto funzionamento ....
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Protocollo
1. cannula e Camera di preparazione
- Inserire capillari di vetro borosilicato pulito (diametro esterno 1,2 mm, diametro interno: 0,69 mm, 10 mm di lunghezza) nelle scanalature di un estrattore pipetta con un filamento di platino (diametro: 100 micron).
- Utilizzo delle impostazioni appropriate, tirare la capillare per generare una cannula con una lunga e sottile punta (Figura 2) con un estrattore micropipetta. Le impostazioni utilizzate sono: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10.
- Inserire la cannula nel supporto della camera di myograph pressione. Allineare le cannule in modo appropriato.
- rompere attentame....
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Risultati
La figura 5A mostra una costrizione rappresentante PAs topo a 60 mM KCl aCSF per valutare l'integrità del preparato. PAs dovrebbe costringere tra il 15 - 30% in presenza di 60 mM KCl. Se la costrizione è inferiore al 15%, scartare il PA e cannulate altro, in quanto suggerisce che l'arteriole stato danneggiato durante il processo di isolamento e cannulazione.
La figura 5B illustra PA co.......
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Discussione
arteriole parenchima cerebrale sono arteriole ad alta resistenza con poche anastomosi e rami che profumato popolazioni neuronali distinti. Questi vasi sanguigni specializzati sono giocatori centrali di autoregolazione cerebrovascolare e accoppiamento neurovascolare attraverso la vasodilatazione mediata astrociti-1. L'importanza di questi vasi sanguigni specializzati nella malattia vascolare cerebrale è noto da circa 50 anni, quando il lavoro pionieristico del Dr. Miller Fisher descritto alterazioni strutt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Finanziato da NHLBI R01HL091905 (SE), dalla United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) e da AHA 15POST247200 (PWP). Gli autori desiderano ringraziare Samantha P. Ahchay per aver fornito l'immagine nella Figura 1 e il Dr. Gerry Herrera, Ph.D., per aver fornito commenti critici sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Liquido cerebrospinale artificiale | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anidro | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolamento/Incannulamento | |||
| Stereomicroscopio | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Ropeps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μ l | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0,2 μ m Filtro per siringa sterile | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instruments | P-97 | |
| Vetro borosilicato O.D.: 1,2 mm, D.I.: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Filettatura di nylon verde scuro Sistemi | viventi Strumentazione | THR-G | |
| Allineamento lineare Sistemi abitativi a camera a vaso singolo | Strumentazione | CH-1-LIN | |
| pressione con pompa peristaltica Sistemi | viventi Strumentazione | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | viventi Strumentazione | VDA-10 | |
| Registratore a quattro canali con software di registrazione e analisi LabScribe 3 | Sistemi viventi Strumentazione | DAQ-IWORX-404 | |
| Unità | di riscaldamentoWarner Instruments | 64-0102 | |
| Regolatore di temperatura automatico | Warner Instruments | TC-324B |
Riferimenti
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Al....
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Ristampe e permessi
