Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
Intrazerebrale parenchymal Arteriolen (PAs), die parenchymal Arteriolen umfassen, eindringende Arteriolen und präkapillaren Arteriolen, sind hohe Beständigkeit Blutgefäße aus pialen Arterien und Arteriolen und tauchen in das Hirnparenchym Verzweigung. Einzelne PA einen diskreten zylindrischen Gebiet des Parenchyms perfuse und die Neuronen darin enthaltenen. Diese Arteriolen sind ein zentraler Akteur in der Regulation des zerebralen Blutflusses global beide (zerebrovaskuläre Autoregulation) und lokal (funktionelle Hyperämie). PAs sind Teil der neurovaskuläre Einheit, eine Struktur, die innerhalb des Gehirns regionalen Blutfluss zu Stoffwechselaktivität entspricht, und umfasst auch Neuronen, Inter und Astrozyten. Perfusion durch PAs ist mit der Aktivität von Neuronen in diesem bestimmten Gebiet und steigt in neuronalen Metabolismus führen zu einer Vermehrung der lokalen Perfusion verursacht durch Dilatation des Zuführungs PA verknüpft. Verordnung von PAs unterscheidet sich von der besser charakterisiertepialen Arterien. Druck-induzierte Vasokonstriktion größer in PAs und gefäßerweiternde Mechanismen variieren. Darüber hinaus erhalte PAs nicht extrinsische Innervation von perivaskulären Nerven – Innervation ist intrinsische und indirekt in der Natur durch den Kontakt mit astrozytären Endfüßen. So Regelung in Bezug auf Datenkontraktions durch Studien angehäuft pialen Arterien mit übersetzt nicht direkt an Funktion PA zu verstehen. Weiterhin bleibt es unbestimmt, wie pathologische Zustände, wie Bluthochdruck und Diabetes, PA Struktur und Reaktivität beeinflussen. Diese Wissenslücke ist eine Folge der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit PA Isolierung und Kanülierung teilweise. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung und Kanülierung Nagetier PAs. Weiterhin zeigen wir Beispiele von Experimenten, die mit diesen Arteriolen durchgeführt werden kann, einschließlich Agonisten induzierte Konstriktion und myogenen Reaktivität. Obwohl der Schwerpunkt dieses Manuskript auf PA Kanülierung und Druck Myographie ist, isoliert PAs kann auch für die biochemische, biophysikalische, molekularen und Imaging-Studien verwendet werden.
Introduction
Die cerebrale Durchblutung wird eindeutig organisiert die metabolischen Anforderungen von zentralen Neuronen zu unterstützen, Zellen, die Energie speichert und sind daher sehr empfindlich gegenüber Veränderungen in der Sauerstoffdruck und die Lieferung von notwendigen Nährstoffe begrenzt haben. Als besondere neuronale Subpopulationen aktiv wird , wenn bestimmte Aufgaben durchgeführt werden, fördert die Gefäß eine stark lokalisierte Zunahme der Perfusion 1 lokale Hypoxie und die Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Dies ist eine Form von funktionellen Hyperämie als neurovaskulären Kopplung bekannt ist , und ist abhängig von der einwandfreien Betrieb der Gefäß – Nerven – Einheit, bestehend aus aktiven Neuronen, Astrozyten und Hirnarterien 2. Intrazerebrale parenchymal Arteriolen, eine Gruppe von Blutgefäßen parenchymal umfasst, durchdringt und präkapillaren Arteriolen, sind für diese Reaktion von zentraler Bedeutung , und es ist dann kritisch , sie einzeln zu untersuchen , um 3 neurovaskulären Kopplung zu untersuchen.
<p class = "jove_content"> Parenchymale Arteriolen sind klein (20 bis 70 & mgr; m Innendurchmesser) mit hohem Widerstand der Blutgefäße, die unterschiedliche neuronale Populationen im Gehirn perfuse. Verästelung von pial Arterien auf der Oberfläche eindringen parenchymalen Arteriolen in das Hirnparenchym zu einem fast 90 ᵒ Winkel des Untergrundes der Mikrozirkulation zu füttern (Abbildung 1). Diese Arteriolen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der entsprechenden Perfusionsdruck, da sie die am weitesten distal gelegene glatten Muskulatur haltigen Gefäßen Schutz der Kapillaren sind. Im Gegensatz zu der Oberfläche pialen Zirkulation fehlt parenchymal Arteriolen Nebenzweige und Anastomosen und folglich sind "Engpässe" der zerebralen Durchblutung 4. Als Ergebnis trägt Dysfunktion von parenchymalen Arteriolen zur Entwicklung von zerebrovaskulären Krankheiten wie vaskulären kognitiver Beeinträchtigung und kleine ischämischen Schlaganfällen (auch als stille oder lacunar Hübe bekannt). Studien INDICATe , dass Dysfunktion parenchymal Arteriolen durch essentielle Hypertonie 5, chronischem Stress 6 und ist ein frühes Ereignis in Modell genetischen Maus Kleingefäßerkrankung 7 induziert werden. Weiterhin ist experimentell induzierten Okklusion einzelner eindringende Arteriolen bei Ratten ausreichend kleinen ischämischen Schlaganfällen zu verursachen, die zylindrisch sind in Form, ähnlich 8 bei älteren Menschen beobachtet diese.Zusätzlich zu diesen anatomischen Unterschiede, Funktionsmechanismen Regulieren kontraktilen unterscheiden zwischen pial Arterien und Arteriolen Parenchym. Myogenen Vasokonstriktion größer in parenchymalen Arteriolen 9, möglicherweise wegen des Mangels an extrinsischen Innervation 10, verschiedene Arten der Mechanotransduktion 11 und Unterschieden in der intrazellulären Ca 2+ 12,13 in vaskulären glatten Muskelzellen signalisiert. Hinweise darauf, dass Endothel-abhängige gefäßerweiternde Mechanismen unterscheiden sich auch zwischen diesen Vascular Segmente mit einem stärkeren Vertrauen auf Mechanismen aufweisen parenchymal Arterien beteiligt Ca 2+ -aktivierten K + -Kanäle und elektrotonische Kommunikation innerhalb der Gefäßwand im Vergleich zu diffusionsfähig Faktoren wie Stickoxid und Prostazykline 14. Daher gesammelten Daten in Experimenten pialen Arterien verwendet, kann nicht unbedingt gelten Arteriolen parenchymal, eine Lücke in unserem Wissen über die lokalen Kontrolle der zerebralen Perfusion zu verlassen.
Trotz ihrer Bedeutung sind parenchymal Arteriolen in beträchtlichem Ausmaß untersuchtes, in erster Linie aufgrund der technischen Herausforderungen , mit Isolierung und Montage für Ex – vivo – Studie. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und zerebrale parenchymale Arteriolen kanülieren, die für Druck Myographie verwendet werden kann oder das Gewebe für Immunomarkierung, Elektrophysiologie, Molekularbiologie, und biochemische Analyse zu isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebral parenchymal Arteriolen sind hohe Beständigkeit Arteriolen mit wenigen Anastomosen und Zweige, die unterschiedliche neuronale Populationen perfuse. Diese spezialisierten Blutgefäße sind zentrale Akteure bei zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung durch Astrozyten vermittelte Vasodilatation 1. Die Bedeutung dieser spezialisierten Blutgefäße in der zerebralen Gefäßerkrankung ist seit etwa 50 Jahren bekannt, als die Pionierarbeit von Dr. Miller Fisher in den Gebieten von la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Riferimenti
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
