अलगाव और सेरेब्रल Parenchymal धमनियों की नलिका
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
इन्ट्रासेरेब्रल parenchymal धमनियों (पीए) है, जो धमनियों parenchymal, मर्मज्ञ धमनियों और पूर्व केशिका धमनियों में शामिल हैं, उच्च प्रतिरोध रक्त मस्तिष्क पैरेन्काइमा में pial धमनियों और धमनियों और गोताखोरी से बाहर शाखाओं में बंटी जहाजों कर रहे हैं। व्यक्तिगत पीए पैरेन्काइमा के एक असतत बेलनाकार क्षेत्र और भीतर निहित न्यूरॉन्स छिड़कना। इन धमनियों मस्तिष्क में रक्त प्रवाह दोनों विश्व स्तर पर (cerebrovascular autoregulation) और स्थानीय स्तर पर (कार्यात्मक hyperemia) के नियमन में एक केंद्रीय खिलाड़ी हैं। पीए neurovascular इकाई, एक संरचना है कि मस्तिष्क के भीतर चयापचय गतिविधि के लिए क्षेत्रीय रक्त के प्रवाह के मैचों का हिस्सा हैं और यह भी न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और astrocytes भी शामिल है। पीए के माध्यम से छिड़काव सीधे स्थानीय फ़ीड पीए के फैलाव की वजह से छिड़काव में एक वृद्धि करने के लिए है कि विशेष क्षेत्र में न्यूरॉन्स और न्यूरोनल चयापचय नेतृत्व में बढ़ जाती है की गतिविधि से जुड़ा हुआ है। पीए के नियमन की बेहतर से विशेषता है कि से अलग हैpial धमनियों। दबाव प्रेरित वाहिकासंकीर्णन पीए में अधिक से अधिक है और vasodilatory तंत्र से भिन्न हो। इसके अलावा, पीए परिवाहकीय नसों से बाह्य इन्नेर्वतिओन प्राप्त नहीं है – इन्नेर्वतिओन astrocytic endfeet के साथ संपर्क के माध्यम से आंतरिक और प्रकृति में अप्रत्यक्ष है। इस प्रकार, सिकुड़ा विनियमन के बारे में डेटा pial धमनियों का उपयोग अध्ययन द्वारा संचित सीधे पीए समारोह को समझने के लिए अनुवाद नहीं है। इसके अलावा, यह अनिर्धारित रहता है कि कैसे इस तरह के उच्च रक्तचाप और मधुमेह जैसे रोग राज्यों, पीए संरचना और जेट प्रभावित करते हैं। यह ज्ञान की खाई हिस्से में तकनीकी पीए अलगाव और केन्युलेशन से संबंधित कठिनाइयों का परिणाम है। इस पांडुलिपि में हम अलगाव और कृंतक क़दम के केन्युलेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्रयोगों है कि एगोनिस्ट प्रेरित कसना और myogenic जेट सहित इन धमनियों के साथ किया जा सकता है के उदाहरण दिखाते हैं। हालांकि इस पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित पीए केन्युलेशन और दबाव myography पर है, पीए अलग-थलगभी, जैव रासायनिक biophysical, आणविक, और इमेजिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क परिसंचरण अनोखे केंद्रीय न्यूरॉन्स, कोशिकाओं है कि ऊर्जा भंडार सीमित है और इसके परिणामस्वरूप अत्यधिक ऑक्सीजन दबाव और आवश्यक पोषक तत्वों की आपूर्ति में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं की चयापचय की मांग का समर्थन करने के लिए आयोजित किया जाता है। विशेष न्यूरोनल उप-जनसंख्या सक्रिय हो जाता है जब विशिष्ट कार्यों प्रदर्शन कर रहे हैं, वाहिका स्थानीय हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी को रोकने के लिए 1 छिड़काव में एक अत्यधिक स्थानीय वृद्धि को बढ़ावा देता है। यह कार्यात्मक neurovascular युग्मन के रूप में जाना hyperemia के एक फार्म सक्रिय न्यूरॉन्स, astrocytes, और मस्तिष्क धमनियों 2 से बना है, और neurovascular इकाई के समुचित संचालन पर निर्भर है। इन्ट्रासेरेब्रल parenchymal धमनियों, रक्त वाहिकाओं, parenchymal शामिल मर्मज्ञ और पूर्व केशिका धमनियों का एक समूह है, इस प्रतिक्रिया के लिए केंद्रीय रूप से महत्वपूर्ण हैं और यह उनके आदेश neurovascular युग्मन 3 की जांच करने में व्यक्तिगत रूप से अध्ययन करने के लिए तो महत्वपूर्ण है।
<(- 70 माइक्रोन आंतरिक व्यास 20) उच्च प्रतिरोध रक्त वाहिकाओं है कि मस्तिष्क के भीतर अलग neuronal आबादी छिड़कना पी वर्ग = "jove_content"> Parenchymal धमनियों छोटे हैं। सतह पर pial धमनियों से बाहर शाखाओं में बंटी, parenchymal धमनियों उपसतह microcirculation (चित्रा 1) को खिलाने के लिए एक लगभग 90 ᵒ कोण पर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में घुसना। इन धमनियों उचित छिड़काव दबाव बनाए रखने के रूप में वे सबसे बाहर का चिकनी मांसपेशियों युक्त केशिकाओं की रक्षा जहाजों कर रहे हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सतह pial संचलन के विपरीत, parenchymal धमनियों जमानत के शाखाओं और anastomoses की कमी है, और फलस्वरूप मस्तिष्क परिसंचरण 4 की "बाधाओं" कर रहे हैं। नतीजतन, parenchymal धमनियों के रोग ऐसे संवहनी संज्ञानात्मक हानि और छोटे इस्कीमिक स्ट्रोक (यह भी चुप या lacunar स्ट्रोक के रूप में जाना जाता है) के रूप में cerebrovascular रोग के विकास के लिए योगदान देता है। अध्ययन indicatई है कि parenchymal धमनियों में शिथिलता आवश्यक उच्च रक्तचाप 5, 6 पुराने तनाव से प्रेरित किया जा सकता है, और छोटे वाहिका रोग आनुवंशिक माउस मॉडल 7 में एक प्रारंभिक घटना है। चूहों में एकल मर्मज्ञ धमनियों के अलावा, प्रयोगात्मक प्रेरित रोड़ा छोटे इस्कीमिक स्ट्रोक कि आकार में बेलनाकार, समान हैं पुराने मनुष्य 8 में मनाया उन लोगों पैदा करने के लिए पर्याप्त है।इन संरचनात्मक भेद के अलावा, सिकुड़ा समारोह को विनियमित तंत्र pial धमनियों और parenchymal धमनियों के बीच मतभेद है। Myogenic वाहिकासंकीर्णन संभवतः intracellular सीए में बाह्य तंत्रिका वितरण 10, 11 mechanotransduction के अलग मोड, और मतभेदों की कमी 2+ संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में 12,13 संकेत की वजह से parenchymal धमनियों 9 में अधिक से अधिक है। सबूत बताते हैं कि endothelium निर्भर vasodilator तंत्र भी इन vascu के बीच अलगLAR क्षेत्रों, सीए 2 से जुड़े तंत्र पर अधिक निर्भरता का प्रदर्शन करते parenchymal धमनियों के साथ इस तरह नाइट्रिक ऑक्साइड और prostacyclins 14 के रूप में प्रसारण कारकों के साथ तुलना कश्मीर + चैनलों और इलेक्ट्रोटोनिक संचार -activated संवहनी दीवार के भीतर। इसलिए, डेटा pial धमनियों का उपयोग कर जरूरी धमनियों Parenchymal करने के लिए लागू नहीं हो सकता प्रयोगों में इकट्ठे हुए, प्रमस्तिष्क छिड़काव के स्थानीय नियंत्रण के हमारे ज्ञान में एक अंतराल छोड़ने।
उनके महत्व के बावजूद, parenchymal धमनियों बेहद तहत अध्ययन किया है, मुख्य रूप से अलगाव और पूर्व vivo अध्ययन के लिए बढ़ते के साथ तकनीकी चुनौतियों के कारण हैं। इस पांडुलिपि में हम अलग-थलग और मस्तिष्क धमनियों parenchymal cannulate, जो दबाव myography के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या immunolabeling, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक जीव विज्ञान, और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए ऊतक को अलग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेरेब्रल parenchymal धमनियों कुछ anastomoses और शाखाओं कि अलग neuronal आबादी छिड़कना के साथ उच्च प्रतिरोध धमनियों हैं। ये विशेष रक्त वाहिकाओं astrocyte की मध्यस्थता वैसोडायलेटेशन 1 के माध्यम से cerebrovascular autoregulation और neurovascular युग्मन ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Riferimenti
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